Bu protokol, nöromüsküler patolojileri araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel 3D in vitro insan nöromüsküler kavşaklarının nasıl tasarlanacağını açıklamaktadır. Bu teknik eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve video işleme kullanır. Gelişim sırasında nöromüsküler bileşke fonksiyonunda ve myastenia gravis hastalarından nörotoksinler ve serum gibi dış faktörlere bağlı olarak ölçülen değişikliklerdir.
Kas hücresi ve motor nöronun biyoreaktöre tohumlanmasını içeren adımlar ilk başta zor olabilir. Kollajen jel karışımını buz üzerinde tutmak, jel katılaşmadan önce tüm hücrelerin tohumlanması için mevcut süreyi uzatmaya yardımcı olabilir. Polidimetilsiloksan veya PDMS'nin kürleme maddesi karışımına 10'a 1 baz karıştırarak başlayın ve karışımı bir vakum odasına yerleştirin.
Tüm vanaları kapatın ve hava kabarcıkları kalmayana kadar karışımın gazını en az 30 dakika boyunca gidermek için vakumu açın. Karışımı kalıplara dökün ve kalıpları vakum odasında 1 saat boyunca gazdan arındırın, ardından kalıpları kalıbın üst yarısı ile doğru yönde kapatın. Merkeze altıgen çelik bir çubuk yerleştirin ve her iki tarafa da kelepçeleyin.
Daha sonra, üst kısmı PDMS ile doldurun ve kalıpları 65 santigrat derecelik bir fırında en az 4 saat kürleyin. Kalıplar oda sıcaklığına soğuduktan sonra, platformları kalıplardan çıkarın. Bu arada, cam örtü 30 dakika boyunca% 1 iyonik olmayan yüzey aktif madde pololünde kayar, kapak kaymalarının istiflenmemesini ve hepsinin uygun şekilde kaplanmasını sağlar, daha sonra damıtılmış suyla iyice durulayın ve gece boyunca 65 santigrat derecede kurutun.
Cam kapak kaymalarını ve PDMS platformunu, 1 ila 2 dakika boyunca dakikada 6 litre oksijen içeren yüksek bir plazma temizleyici kullanarak tedavi edin. Tedavi edildikten sonra, PDMS'yi en az 30 saniye boyunca kapak kaymasına bastırarak ikisini birbirine bağlayın. Mililitre kollajen 1 ve çözünür bazal membran matrisi başına 3 miligramlık 4'e 1 karışım hazırlayın, ardından miyoblastları bu taze hazırlanmış kollajen karışımında yeniden askıya alın.
Daha sonra, biyoreaktörün her kas odasına bu hücre-kollajen süspansiyonunun 15 mikrolitresini ekleyin ve pipet ucunu kullanarak süspansiyonu her iki sütuna da yaydığınızdan emin olun. Hücre jeli karışımının 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin, ardından her biyoreaktörü 450 mikrolitre miyotonik büyüme ortamı ile iyice doldurun. Motonöron farklılaşmasının 11. gününde, hücreleri ve medyayı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve nörosferlerin 5 dakika boyunca dibe çökmesine izin verin.
Süpernatantı aspire edin ve hücreleri, mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ve glial hücre kaynaklı nörotrofik faktörün mililitresi başına 10 nanogram ile desteklenmiş 15 mililitre motonöron süspansiyon kültürü ortamında yeniden askıya alın. Farklılaşma protokollerinin 14. gününde, motonöronları platforma tohumlayın. Mililitre kollajen 1 başına 2 miligramlık 4'e 1 jel karışımı ve çözünür bazal membran matrisi hazırlayın.
Büyük nörosferleri seçmek ve hazırlanan jel karışımında yeniden askıya almak için 400 nanometrelik bir hücre süzgeci kullanın. Rezervuardan ve nörosferden gelen ortamları dikkatlice aspire edin, ardından nörosfer kanalına 15 mikrolitre jel karışımı ekleyin. 10 mikrolitrelik bir pipeti 10 mikrolitre jel ile yükleyin ve bir nörosfer seçin.
Nörosferi nörosfer kanalına yatırın, odada olduğundan emin olun, ardından nörosfer biriktikten sonra kalan jeli serbest bırakırken pipeti yavaşça kaldırın. Jelin 37 santigrat derecede 30 dakika polimerize olmasına izin verin, daha sonra rezervuarlara mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ve glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör mililitre başına 10 nanogram ile desteklenmiş 450 mikrolitre NbActiv4 ekleyin. Görüntüleme için, bilimsel bir tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera yazılımına sahip ters bir floresan mikroskop kullanın.
Bağlamayı 2x2, Pozlama değerini 20 milisaniyeye, Deklanşör açık, Okuma Hızını 540 megahertz'e, dinamik aralığı 12 bit'e, Kazanç 1'e ve Sensör Modu'nu Üst Üste Binme olarak ayarlayın. Mikrodokuları görüntülemek ve mikroskop aşamasına canlı hücre haznesi eklemek için mikroskopta 2x objektif kullanın. Dosya boyutunu ve işleme süresini en aza indirmek için innerve iskelet dokularını içeren ilgili bölgeyi seçin, ardından kameradan mavi ışık darbelerini filtrelemek için numune ile görüntüleme hedefi arasına 594 nanometre uzun geçişli bir emisyon filtresi yerleştirin.
Ardından, canlı hücre odasına dört biyoreaktör içeren dikdörtgen bir 4 delikli plaka yerleştirin, ardından canlı görüntüye tıklayın ve ortalayın ve görüntüyü istediğiniz yatırım getirisi ile odaklayın. Sahne alanı konumunu, Arduino kartını ve video alımını denetlemek için GitHub klasöründen özel makro kodunu indirin, ardından çıktı filmini gün alt çizgi doku grubu alt çizgi doku adı alt çizgi deneyi noktası ND2 olarak ayarlayın. Makro kodunu sahne alanında ayarlanan istenen X ve Y koordinatlarıyla çalıştırın ve saniyede 50 karede 1700 kare ile hızlı bir zaman atlaması elde edin.
Görüntülemeden sonra, ortamı değiştirin ve örnekleri inkübatöre geri gönderin. Doku yorgunluğunu önlemek için görüntü alma oturumları arasında en az 24 saat bekleyin. Film işleme için GitHub klasöründen dosyaları indirin ve videoları toplu analizde işlemek için özel MATLAB kodunu kullanın.
Edinilen tüm videoların aynı klasörde olması için özyinelemeli işletim sistemi analiz komut dosyasını açın. Ön analiz parametrelerini ayarlayın ve filmleri paralel işleme yoluyla analiz etmek için özyinelemeli OSAnalysis komut dosyasını çalıştırın. Temel süre, tepe eşiği, min-min belirginliği ve min-min genişliği gibi analiz sonrası parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
Son olarak, ilgili kontraktilitesi izleyen her doku için bir video dosyası oluşturmak üzere recursiveOSMovie komutunu çalıştırarak video ve grafik çıktısı oluşturun. Bu protokol, farklı ölçeklere sahip iki sistem, yaklaşık 20.000 miyoblasttan oluşan 1 milimetre uzunluğunda iskelet kası dokuları üreten mikroakışkan bir cihaz ve yaklaşık 450 miyoblasttan oluşan 4 milimetre uzunluğundaki kas dokuları ile sonuçlanan açık kuyulu biyoreaktör sistemi kullanılarak test edilmiştir. Motonöronların mavi ışıkla kontrollü bir şekilde uyarılmasına izin vermek için optik bir kurulum inşa edildi ve NMJ işlevi, özel bir Arduino koduyla eşleştirilmiş özel bir mikroskop makro komut dosyası kullanılarak yükseltildi.
Bu kod, ayarlanabilir ayarlanabilir parametreleri içerir ve bir ışık darbesi ile kontraktilite zirvesinin başlangıcı arasındaki süreye bağlı olarak bir büzülmenin tetiklenip tetiklenmeyeceğini belirler. Sistem, doku imalatından bir hafta sonra tetiklenen yanıtlarda bir artış gösteren dokulardaki NMJ fonksiyonunun iyileşmesini yakaladı ve bunu bir hafta daha stabil bir fonksiyon izledi. Alfa-bungarotoksin, NMJ fonksiyonunun tamamen bozulmasına neden olan tüm tetiklenmiş ve spontan kasılmaları durdurdu ve dokuların ışık stimülasyonunun fonksiyonel bir NMJ gerektirdiğini gösterdi.
48 saat boyunca% 20 miyastenia gravis serumu ile tedavi edilen dokuların analizi, sağlıklı donörlerden serum ile tedavi edilen kontrol dokularına kıyasla fonksiyonun azaldığını göstermiştir. Serumun çıkarılmasından ve yıkanmasından 48 saat sonra, mühendislik NMJ'leri fonksiyonun geri kazanıldığını gösterdi. Partiler arasında sertlik değişkenliğini önlemek için tüm biyoreaktörlerin fırında eşit süre kaldığından emin olun.
Ayrıca, mikroskop kullanarak motor nöron tohumlamasını doğruladığınızdan emin olun. Bu prosedürü takiben, ek bilgi toplamak ve hastalıklı serumun neden olduğu mekanik değişiklikleri daha iyi anlamak için metabalomik, proteomik ve CRISPR taraması yapılabilir.
