Questo protocollo descrive come progettare giunzioni neuromuscolari umane 3D funzionali in vitro che possono essere utilizzate per studiare patologie neuromuscolari e testare potenziali terapie. Questa tecnica utilizza la stimolazione optogenetica simultanea e l'elaborazione video. Sono cambiamenti quantificati nella funzione di giunzione neuromuscolare durante lo sviluppo e a causa di fattori esterni, come neurotossine e siero da pazienti con miastenia grave.
I passaggi che coinvolgono la cellula muscolare e il motoneurone che seminano nel bioreattore possono essere impegnativi all'inizio. Mantenere la miscela di gel di collagene sul ghiaccio può aiutare a prolungare il tempo disponibile per seminare tutte le cellule prima che il gel si solidifichi. Iniziare mescolando una base 10 a 1 alla miscela di agenti polimerizzanti di polidimetilsilossano o PDMS e posizionare la miscela in una camera a vuoto.
Chiudere tutte le valvole e accendere il vuoto per degassare la miscela per almeno 30 minuti fino a quando non rimangono bolle d'aria. Versare la miscela negli stampi e degassare gli stampi nella camera a vuoto per 1 ora, quindi chiudere gli stampi con la metà superiore dello stampo nel corretto orientamento. Posizionare un'asta di acciaio esagonale sopra il centro e bloccare su entrambi i lati.
Quindi, riempire la parte superiore con PDMS e polimerizzare gli stampi in un forno a 65 gradi Celsius per almeno 4 ore. Dopo che gli stampi si sono raffreddati a temperatura ambiente, rimuovere le piattaforme dagli stampi. Nel frattempo, il coperchio di vetro scivola in poliolo tensioattivo non ionico all'1% per 30 minuti, assicurandosi che gli scivoli di copertura non si impilano e siano tutti adeguatamente rivestiti, quindi sciacquarli bene con acqua distillata e asciugarli durante la notte a 65 gradi Celsius.
Trattare gli scivoli del coperchio in vetro e la piattaforma PDMS utilizzando un detergente al plasma in alto con 6 litri al minuto di ossigeno per 1 o 2 minuti. Una volta trattati, legare i due insieme premendo il PDMS verso il basso sul coperchio scivolare per almeno 30 secondi. Preparare una miscela 4 a 1 di 3 milligrammi per millilitro di collagene 1 e matrice di membrana basale solubilizzata, quindi risospesciare i mioblasti in questa miscela di collagene appena preparata.
Quindi, aggiungere 15 microlitri di questa sospensione di collagene cellulare a ciascuna camera muscolare del bioreattore, assicurandosi di distribuire la sospensione su entrambi i pilastri utilizzando la punta della pipetta. Lasciare polimerizzare la miscela di gel cellulare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi riempire bene ogni bioreattore con 450 microlitri di mezzi di crescita miotonici. Il giorno 11 della differenziazione del motoneurone, trasferire le cellule e i mezzi in un tubo da 50 millilitri e consentire alle neurosfere di depositarsi sul fondo per 5 minuti.
Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 15 millilitri di terreno di coltura di sospensione di motoneurone integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e 10 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato da cellule gliali. Il giorno 14 dei protocolli di differenziazione, semina i motoneuroni nella piattaforma. Preparare una miscela di gel 4 a 1 di 2 milligrammi per millilitro di collagene 1 e matrice di membrana basale solubilizzata.
Utilizzare un filtro cellulare a 400 nanometri per selezionare grandi neurosfere e risospenderle nella miscela di gel preparata. Aspirare accuratamente i mezzi dal serbatoio e dalla neurosfera bene, quindi aggiungere 15 microlitri della miscela di gel nel canale della neurosfera. Carica una pipetta da 10 microliti con 10 microlitri di gel e scegli una neurosfera.
Depositare la neurosfera nel canale della neurosfera, assicurandosi che sia nella camera, quindi sollevare lentamente la pipetta mentre si rilascia il gel rimanente una volta depositata la neurosfera. Lasciare polimerizzare il gel per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi aggiungere 450 microlitri di NbActiv4 integrati con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e 10 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali ai serbatoi. Per l'imaging, utilizzare un microscopio fluorescente invertito con un software scientifico complementare per fotocamere a semiconduttore di ossido di metallo.
Impostare Binning su 2 per 2, Esposizione a 20 millisecondi, Rolling shutter acceso, Velocità di lettura a 540 megahertz, Gamma dinamica a 12 bit e Guadagno 1 e Modalità sensore su Sovrapposizione. Utilizzare un obiettivo 2x sul microscopio per visualizzare i microtessuti e collegare una camera a cellule vive allo stadio del microscopio. Selezionare la regione di interesse che contiene i tessuti scheletrici innervati per ridurre al minimo le dimensioni del file e il tempo di elaborazione, quindi posizionare un filtro di emissione a lungo passaggio di 594 nanometri tra il campione e l'obiettivo di imaging per filtrare gli impulsi di luce blu dalla fotocamera.
Quindi, posizionare una piastra rettangolare a 4 pozzetti contenente quattro bioreattori nella camera delle cellule vive, quindi fare clic su live view e centrare e mettere a fuoco l'immagine con il ROI desiderato. Scarica il codice macro personalizzato dalla cartella GitHub per controllare la posizione dello stage, la scheda Arduino e l'acquisizione video, quindi imposta il filmato di output come day underscore tissue group underscore tissue name underscore experiment dot ND2. Esegui il codice macro con le coordinate X e Y desiderate impostate sullo stage e acquisisci un time lapse veloce con 1700 fotogrammi a 50 fotogrammi al secondo.
Dopo l'imaging, sostituire il supporto e restituire i campioni all'incubatore. Attendere almeno 24 ore tra le sessioni di acquisizione delle immagini per evitare l'affaticamento dei tessuti. Per l'elaborazione dei filmati, scarica i file dalla cartella GitHub e utilizza il codice MATLAB personalizzato per elaborare i video in analisi batch.
Apri lo script di analisi ricorsiva del sistema operativo per avere tutti i video acquisiti nella stessa cartella. Regolare i parametri di pre-analisi ed eseguire lo script recursiveOSAnalysis per analizzare i filmati tramite elaborazione parallela. Regola i parametri post-analisi come il tempo di base, la soglia di picco, la prominenza min-min e la larghezza min-min in base alle esigenze.
Infine, genera output video e grafico eseguendo recursiveOSMovie per generare un file video per ogni tessuto con la rispettiva traccia di contrattilità. Questo protocollo è stato testato utilizzando due sistemi con scale diverse, un dispositivo microfluidico che produce tessuti muscolari scheletrici lunghi 1 millimetro che comprendono circa 20.000 mioblasti e il sistema di bioreattori a pozzo aperto che produce tessuti muscolari lunghi 4 millimetri che comprendono circa 450 mioblasti. È stata costruita una configurazione ottica per consentire la stimolazione controllata dei motoneuroni con luce blu e la funzione NMJ è stata elevata utilizzando uno script macro del microscopio personalizzato abbinato a un codice Arduino personalizzato.
Questo codice include parametri regolabili sintonizzabili e determina se viene attivata una contrazione in base al tempo tra un impulso luminoso e l'inizio del picco di contrattilità. Il sistema ha catturato il miglioramento della funzione NMJ nei tessuti mostrando un aumento delle risposte innescate una settimana dopo la fabbricazione dei tessuti, seguito da una funzione stabile per un'ulteriore settimana. L'alfa-bungarotossina ha fermato tutte le contrazioni innescate e spontanee con conseguente completa interruzione della funzione NMJ, dimostrando che la stimolazione leggera dei tessuti richiede un NMJ funzionale.
L'analisi dei tessuti trattati con il 20% di miastenia grave per 48 ore ha mostrato una diminuzione della funzione rispetto ai tessuti di controllo trattati con siero di donatori sani. 48 ore dopo aver rimosso e lavato il siero, gli NMJ ingegnerizzati hanno mostrato un recupero della funzione. Assicurarsi che tutti i bioreattori siano in forno per lo stesso tempo per evitare la variabilità di rigidità tra i lotti.
Inoltre, assicurati di verificare la semina del motoneurone usando il microscopio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metabalomica, proteomica e screening CRISPR per raccogliere ulteriori informazioni e comprendere meglio i cambiamenti meccanicistici causati dal siero malato.
