המטבוליטים שמשתחררים על-ידי המיקרוביוטה של המעיים מייצרים השפעות מורכבות על הפונדקאי. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקור את תפקידם של מטבוליטים במעיים במוח העכבר ובהתנהגותו. טכניקה זו מספקת שיטה מדויקת, מוקפדת ומאומתת להעברת מטבוליטים של המעיים למוח בעכברים הנעים בחופשיות.
אנו מספקים את המתודולוגיה המקיפה והפיזיולוגית הטובה ביותר לתובנות על חקר ציר המוח במעיים. הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית ותקן את החותכות של העכבר על פס החותך במחזיק החותך הסטריאוטקסי. מכסים את האף במסכת חרוט האף.
לאחר מכן להעריך את nociception של העכבר באמצעות רפלקס צביטה העליון, ולהבטיח קצב נשימה קבוע לפני חתירה באתר הניתוח. לאחר גזום פרווה על הראש מוסר על ידי סרט דבק, תת עורית להזריק את ketoprofen משכך כאבים כדי להקל על הכאב ולהחיל משחה העין. לאחר מכן, תקן את הראש על ידי הכנסת מוט האוזן המחודד לתעלת האוזן.
הדקו את מהדק האף על מחזיק החותך ולחצו על הראש בעדינות כדי לוודא שהראש קבוע. השתמש ב-3 קרצוף לסירוגין של ספוגית כלורהקסידין כדי לחטא את הקרקפת. כעת, השתמש באזמל כריתה כדי לבצע חתך של פחות מסנטימטר אחד בקרקפת באופן אחורי קדמי.
לאחר פתיחת החתך, נגבו את הגולגולת בעזרת צמר גפן המוחזק על ידי מלקחיים מיקרו-ניתוחיים. בהתבסס על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות, יש לזהות ולתייג את מיקום החדר הצדדי הימני כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, קדח חור דרך הגולגולת באתר המסומן באמצעות מקדחה סטריאוטקסית, ומאוחר יותר, קדח שניים עד ארבעה חורים נוספים בגולגולת.
נגבו את הגולגולת עם צמר גפן לידוקאין והרכיבו 2 עד 4 ברגים מנירוסטה על החורים. הניחו את צינורית המדריך המסחרי על מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית וחטאו עם מעקר מהירות הזכוכית ב-150 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית לחור שנקדח עבור החדר הצדדי והכניסו באיטיות את צינורית ההנחיה המסחרית לתוך החור עד להשגת העומק הרצוי.
עכשיו להחיל 10 microliters של דבק n-Butyl cyanoacrylate כדי לתקן את צינורית המדריך המסחרי בחור קדח ולחכות 3 עד 4 דקות. יש לשחרר בעדינות את צינורית המדריך המסחרי ממחזיק הצינורית הסטריאוטקסית ולמרוח אקריליק דנטלי על הקרקפת המשופעת כדי לתקן את צינורית המדריך המסחרי ולהמתין לפחות 5 דקות. להשתיל את הדמה המסחרית לתוך צינורית המדריך המסחרי.
לאחר מכן, הכניסו את העכבר לכלוב חדש עם כרית חימום מתחתיו להתאוששות מהרדמה והתבוננו ברציפות עד שהעכבר מתעורר במלואו. הרכב את מזרק המיקרוליטר, המכיל 10 מיקרוליטרים של מים מזוקקים, על משאבת המיקרו-הזרקה. באמצעות מזרק אינסולין, למלא את צינור פוליאתילן עם מים מזוקקים ולחבר את מזרק microliter לצינור פוליאתילן תלוי.
הפעל את בקר המיקרו-הזרקה ולחץ על הצג את כל הערוצים כדי לגשת למסך הפקודה. לאחר מכן, לחץ על תצורה וקבע יעד נפח ל -9, 800 ננוליטר עם קצב אספקה של 100 ננוליטר לשנייה. לאחר מכן לחץ על כיוון כדי לעבור למצב ההחדרה ולחץ על Run כדי להחדיר 9, 800 ננוליטר של מים מזוקקים מצינור הפוליאתילן המחובר למזרק המיקרוליטר.
כעת, הכניסו את המזרק לבקבוקון המכיל את השמן המינרלי, לחצו על תצורת הנפח והגדירו את יעד הנפח ל -3, 000 ננוליטר עם קצב אספקה ל -100 ננוליטר לשנייה. למשיכת 3, 000 ננוליטר של שמן מינרלי, לחץ על כיוון כדי לעבור למצב נסיגה ולאחר מכן לחץ על הפעלה. לפרק את צינור פוליאתילן מן מחט מזרק microliter.
כדי לירוק החוצה 3, 000 ננוליטר של מים מזוקקים ממחט מזרק microliter, לחץ על כיוון לעבור למצב החדרה ולחץ על הפעלה. ואז להכניס את מזרק microliter בחזרה לתוך צינור פוליאתילן. הכניסו את המזרק לבקבוקון המכיל SCFAs.
לחץ על תצורת ההדפסה והגדר את יעד הנפח ל-9, 500 ננוליטר עם קצב אספקה של 100 ננוליטר לשנייה. משוך 9, 500 ננוליטרים של SCFAs על ידי לחיצה על כיוון כדי לעבור למצב משיכה ולחץ על הפעלה. תייג את שלב ה-SCFAs של השמן כדי לוודא אם ה-SCFAs מוחדרים בהצלחה.
לחץ על תצורת ההדפסה והגדר את יעד הנפח הרצוי עם קצב אספקה של 7 ננוליטר לשנייה. לחצו על הכיוון כדי לעבור למצב ההחדרה. לחץ לרוץ כדי להחדיר את מזרק microliter קדימה עד הנוזל יוצא בקצה הקדמי של המזרק המסחרי לפני החדרת המזרק לתוך הצינורית להזרקת SCFAs.
לאחר הרדמת העכבר, הכנס את המזרק המסחרי לתוך צינורית המדריך המסחרי. לאחר שהעכבר מתאושש מההרדמה, הניחו אותו בכלוב חדש ואפשרו לו לחקור במשך 35 דקות בחופשיות. החדירו SCFAs באמצעות קצב אספקה של 7 ננוליטר לשנייה לנפח יעד של 2, 100 ננוליטר ב-5 הדקות הראשונות.
לאחר מכן לחץ על כיוון למצב ההחדרה ולחץ על הפעלה. לאחר בדיקה התנהגותית, הסר את המזרק המסחרי מהצינורית המסחרית. החדירו 2, 100 ננוליטרים של העקיבה הנייטרלית עם קצב אספקה של 7 ננוליטר לשנייה כדי לאמת את אתר העירוי.
דמיינו את האות הפלואורסצנטי באתר העירוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גם עכברים שהוחדרו ל-ACSF וגם עכברים בעלי SCFAs נסעו בכלוב חדש במשך 35 דקות בסך הכל. לא נצפה הבדל בפעילות הלוקומוטורית בכלוב החדש בין עירוי של SCFAs ו- ACSF.
הצבע הפלואורסצנטי זוהה בחדר הצדדי ובאזורים הסובבים את מוח העכבר כאשר הוחדר לו צינורית מנחה מסחרית. באופן דומה, עירוי דרך צינורית מדריך הנירוסטה מוביל לזיהוי אותות בחדר הלטרלי ובאזורים הסובבים את מוח העכבר. שילוב הליך זה עם טכנולוגיות עצביות מבוססות מעגלים יאפשר למדענים לקבל תובנה לגבי השליטה מבוססת המעגלים במוח וההתנהגות שתורמים מטבוליטים במעיים.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור את תפקידם של מיקרוביוטה ומטבוליטים בציר המוח המורכב של המעי.
