Bağırsak mikrobiyotası tarafından salınan metabolitler, konakçı üzerinde karmaşık etkiler yaratır. Bu protokol, bağırsak metabolitlerinin fare beynindeki ve davranışındaki rolünü sorgulamak için bir yöntem sunar. Bu teknik, bağırsak metabolitlerini serbestçe hareket eden farelerde bir beyne iletmek için hassas, titiz ve doğrulanmış bir yöntem sağlar.
Bağırsak beyin ekseni araştırmasına ilişkin içgörü için kapsamlı ve fizyolojik olarak en iyi metodolojiyi sunuyoruz. Fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin ve fare kesici dişlerini stereotaksik kesici tutucudaki kesici çubukta sabitleyin. Burun, burun koni maskesi ile örtün.
Ardından, farenin nosiseptyonunu üst kıstırma refleksi ile değerlendirin ve cerrahi bölgeyi kesmeden önce sabit bir solunum hızı sağlayın. Baştaki kesilmiş kürk yapışkan bant tarafından çıkarıldıktan sonra, ağrıyı hafifletmek ve göz merhemi uygulamak için deri altından analjezik ketoprofen enjekte edin. Ardından, sivri uçlu kulak çubuğunu kulak kanalına yerleştirerek kafayı sabitleyin.
Kesici tutucudaki burun kelepçesini sıkın ve başın sabitlendiğinden emin olmak için kafaya hafifçe bastırın. Kafa derisini dezenfekte etmek için 3 alternatif klorheksidin çubuk fırçası kullanın. Şimdi, kafa derisinde bir santimetreden daha az bir kesi yapmak için diseksiyon neşter kullanın.
Kesini açtıktan sonra, kafatasını mikro diseksiyon forsepsleri tarafından tutulan pamuklu bir çubukla silin. Stereotaksik koordinatlara dayanarak, makalede açıklandığı gibi sağ lateral ventrikülün konumunu tanımlayın ve etiketleyin. Daha sonra, stereotaksik bir matkap kullanarak etiketli bölgedeki kafatasından bir delik açın ve daha sonra kafatasında iki ila dört delik daha açın.
Kafatasını lidokain pamuklu çubukla silin ve deliklere 2 ila 4 paslanmaz vida takın. Ticari kılavuz kanülü stereotaksik kanül tutucuya yerleştirin ve cam hız sterilizatörü ile 150 santigrat derecede dezenfekte edin. Ardından, stereotaksik kanül tutucuyu lateral ventrikül için açılan deliğe taşıyın ve istenen derinliğe ulaşana kadar ticari kılavuz kanülü yavaşça deliğe yerleştirin.
Şimdi ticari kılavuz kanülünü delinmiş deliğe sabitlemek için 10 mikrolitre n-Butil siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve 3 ila 4 dakika bekleyin. Ticari kılavuz kanülü stereotaksik kanül tutucudan yavaşça serbest bırakın ve ticari kılavuz kanülünü sabitlemek için kesilmiş kafa derisine diş akrilik uygulayın ve en az 5 dakika bekleyin. Ticari mankeni ticari rehber kanülüne yerleştirin.
Ardından, anesteziden kurtulmak için fareyi altında bir ısıtma yastığı bulunan yeni bir kafese yerleştirin ve fare tamamen uyanana kadar sürekli gözlemleyin. 10 mikrolitre damıtılmış su içeren mikrolitre şırıngayı mikroenjeksiyon pompasına monte edin. Bir insülin şırıngası kullanarak, polietilen tüpü damıtılmış suyla doldurun ve mikrolitre şırıngayı asılı polietilen tüpe bağlayın.
Mikroenjeksiyon denetleyicisini açın ve komut ekranına erişmek için tüm kanalları görüntüle düğmesine basın. Ardından, yapılandırmaya basın ve saniyede 100 nanolitre teslimat oranıyla hacim hedefini 9.800 nanolitre olarak ayarlayın. Ardından, demleme moduna geçmek için yöne basın ve mikrolitre şırıngaya bağlı polietilen tüpten 9.800 nanolitre damıtılmış su demlemek için çalıştır'a basın.
Şimdi, enjektörü mineral yağı içeren bir şişeye yerleştirin, konfigürasyona basın ve hacim hedefini saniyede 100 nanolitre teslimat oranıyla 3.000 nanolitreye ayarlayın. 3.000 nanolitre mineral yağ çekmek için, çekme moduna geçmek için yöne basın ve ardından çalıştır'a basın. Polietilen tüpü mikrolitre şırınga iğnesinden sökün.
Mikrolitre şırınga iğnesinden 3.000 nanolitre damıtılmış su tükürmek için, demleme moduna geçmek için yöne basın ve çalıştır'a basın. Daha sonra mikrolitre şırıngayı tekrar polietilen tüpe yerleştirin. Enjektörü SCFA'lar içeren bir şişeye yerleştirin.
Konfigürasyona basın ve hacim hedefini saniyede 100 nanolitre teslimat oranıyla 9.500 nanolitreye ayarlayın. Para çekme moduna geçmek için yöne basarak 9.500 nanolitre SCFA'yı geri çekin ve çalıştır'a basın. SCFA'ların başarıyla aşılanıp aşılanmadığını doğrulamak için yağ SCFA'ları aşamasını etiketleyin.
Konfigürasyona basın ve teslimat hızı saniyede 7 nanolitre olan istenen hacim hedefini ayarlayın. Demleme moduna geçmek için yöne basın. SCFA'ların enjeksiyonu için enjektörü kanüle sokmadan önce mikrolitre şırıngayı ticari enjektörün ön ucunda sıvı çıkana kadar ileri doğru inflendirmek için run tuşuna basın.
Fareyi uyuşturduktan sonra, ticari enjektörü ticari kılavuz kanülüne yerleştirin. Fare anesteziden kurtulduktan sonra, yeni bir kafese yerleştirin ve 35 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin. SCFA'ları, ilk 5 dakikada 2.100 nanolitrelik bir hedef hacim için saniyede 7 nanolitrelik bir dağıtım hızı kullanarak infüze edin.
Ardından demleme moduna yön tuşuna basın ve çalıştır'a basın. Davranışsal testlerden sonra, ticari enjektörü ticari kılavuz kanülünden çıkarın. İnfüzyon bölgesini doğrulamak için nötr izleyicinin 2.100 nanolitresini saniyede 7 nanolitre verme oranıyla infüze edin.
İnfüzyon bölgesindeki floresan sinyalini bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Hem ACSF hem de SCFA'larla aşılanmış fareler, toplam 35 dakika boyunca yeni bir kafeste seyahat ettiler. Yeni kafesteki lokomotor aktivitede SCFA'ların infüzyonu ile ACSF arasında fark gözlenmedi.
Floresan boya, ticari bir kılavuz kanül ile aşılandığında lateral ventrikülde ve fare beyninin çevresindeki bölgelerde tespit edildi. Benzer şekilde, paslanmaz çelik kılavuz kanülünden infüzyon, lateral ventriküldeki ve fare beyninin çevresindeki bölgelerdeki sinyallerin algılanmasına yol açar. Bu prosedürü devre tabanlı sinir teknolojileri ile birleştirmek, bilim adamlarının beynin devre tabanlı kontrolü ve bağırsak metabolitlerinin katkıda bulunduğu davranış hakkında fikir edinmelerini sağlayacaktır.
Bu teknik, araştırmacıların mikrobiyota ve metabolitlerin karmaşık bağırsak beyin eksenindeki rolünü keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.
