Метаболиты, высвобождаемые кишечной микробиотой, оказывают комплексное воздействие на хозяина. Этот протокол представляет собой метод опроса о роли метаболитов кишечника в мозге и поведении мыши. Этот метод обеспечивает точный, тщательный и проверенный метод доставки метаболитов кишечника в мозг у свободно движущихся мышей.
Мы предоставляем всеобъемлющую и физиологическую лучшую методологию для понимания исследований оси кишечника мозга. Поместите мышь на стереотаксическую рамку и закрепите резцы мыши на резце в держателе стереотаксического резца. Прикройте нос маской конуса носа.
Затем оцените ноцицепцию мыши с помощью рефлекса верхнего защемления и обеспечьте постоянную частоту дыхания перед вырезанием места операции. После того, как обрезанный мех на голове удаляется клейкой лентой, подкожно вводят анальгетик кетопрофен для снятия боли и наносят глазную мазь. Далее зафиксируйте головку, вставив заостренную ушную перекладину в ушной канал.
Затяните зажим носа на держателе резца и осторожно надавите на голову, чтобы убедиться, что голова закреплена. Используйте 3 чередующихся скраба из мазка хлоргексидина для дезинфекции кожи головы. Теперь используйте рассекающий скальпель, чтобы сделать разрез менее одного сантиметра в коже головы передним задним способом.
После вскрытия разреза протрите череп ватным тампоном, удерживаемым микрорассекающими щипцами. Основываясь на стереотаксических координатах, определите и обозначьте положение правого бокового желудочка, как описано в рукописи. Затем просверлите отверстие через череп на помеченном участке с помощью стереотаксического сверла, а затем просверлите еще два-четыре отверстия в черепе.
Протрите череп лидокаиновым ватным тампоном и установите на отверстия от 2 до 4 нержавеющих винтов. Поместите коммерческую направляющую канюлю на стереотаксический держатель канюли и продезинфицируйте стерилизатор со скоростью стекла при 150 градусах Цельсия. Затем переместите держатель стереотаксической канюли в отверстие, просверленное для бокового желудочка, и медленно вставьте коммерческую направляющую канюлю в отверстие до тех пор, пока не будет достигнута желаемая глубина.
Теперь нанесите 10 микролитров клея n-butyl cyanoacrylate, чтобы зафиксировать канюлю коммерческого гида в просверленном отверстии и подождите от 3 до 4 минут. Осторожно отпустите канюлю коммерческого гида от держателя стереотаксической канюли и нанесите акрил на вырезанную кожу головы, чтобы зафиксировать канюлю коммерческого гида, и подождите не менее 5 минут. Имплантируйте коммерческий манекен в канюлю коммерческого гида.
Затем поместите мышь в новую клетку с грелкой под ней для восстановления после анестезии и непрерывно наблюдайте, пока мышь полностью не проснется. Установите микролитровый шприц, содержащий 10 микролитров дистиллированной воды, на микроинъекционный насос. С помощью инсулинового шприца заполните полиэтиленовую трубку дистиллированной водой и подключите микролитровой шприц к подвесной полиэтиленовой трубке.
Включите контроллер микроинъекции и нажмите кнопку отображения всех каналов для доступа к экрану команд. Затем нажмите конфигурацию и установите целевой объем 9 800 нанолитров со скоростью подачи 100 нанолитров в секунду. Затем нажмите направление для переключения в режим наполнения и нажмите на запуск для вливания 9 800 нанолитров дистиллированной воды из полиэтиленовой трубки, соединенной с микролитром шприца.
Теперь поместите инжектор во флакон, содержащий минеральное масло, нажмите конфигурацию и установите объемную цель на 3000 нанолитров со скоростью доставки до 100 нанолитров в секунду. Для извлечения 3 000 нанолитров минерального масла нажмите направление для переключения в режим вывода, а затем нажмите кнопку запуска. Разберите полиэтиленовую трубку из микролитровой шприцевой иглы.
Чтобы выплюнуть 3 000 нанолитров дистиллированной воды из микролитровой шприцевой иглы, нажмите направление для переключения в режим инфузии и нажмите на запуск. Затем вставьте микролитровый шприц обратно в полиэтиленовую трубку. Поместите инжектор во флакон, содержащий SCFA.
Нажмите конфигурацию и установите целевой объем 9 500 нанолитров со скоростью подачи до 100 нанолитров в секунду. Извлеките 9 500 нанолитров SCFA, нажав направление для переключения в режим вывода и нажмите run. Маркировка фазы SCFAs масла, чтобы проверить, успешно ли введены SCFA.
Нажмите на конфигурацию и установите желаемый объем цели со скоростью подачи до 7 нанолитров в секунду. Нажмите направление, чтобы переключиться в режим infuse. Нажмите, чтобы влить микролитровый шприц вперед, пока жидкость не выйдет на переднем конце коммерческого инжектора, прежде чем вставить инжектор в канюлю для инъекции SCFA.
После обезболивания мыши вставьте коммерческий инжектор в канюлю коммерческого гида. Как только мышь будет восстановлена после анестезии, поместите ее в новую клетку и позвольте ей свободно исследовать в течение 35 минут. Вливайте SCFA, используя скорость доставки 7 нанолитров в секунду для целевого объема 2 100 нанолитров в первые 5 минут.
Затем нажмите направление в режим infuse и нажмите run. После поведенческого тестирования удалите коммерческий инжектор из коммерческой направляющей канюли. Вливание 2, 100 нанолитров нейтрального индикатора со скоростью доставки 7 нанолитров в секунду для проверки места инфузии.
Изобразите флуоресцентный сигнал в месте инфузии с помощью флуоресцентного микроскопа. Мыши, наполненные ACSF и SCFA, путешествовали в новой клетке в общей сложности 35 минут. Не наблюдалось различий в двигательной активности в новой клетке между инфузией SCFA и ACSF.
Флуоресцентный краситель был обнаружен в боковом желудочке и окружающих областях мозга мыши при введении коммерческой направляющей канюли. Аналогичным образом, инфузия через направляющую канюлю из нержавеющей стали приводит к обнаружению сигналов в боковом желудочке и окружающих областях мозга мыши. Сочетание этой процедуры с нейронными технологиями на основе схем позволит ученым получить представление о контроле мозга и поведении на основе схемы, вызванном метаболитами кишечника.
Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы исследовать роль микробиоты и метаболитов в сложной оси мозга кишечника.
