Os metabólitos liberados pela microbiota intestinal produzem efeitos complexos sobre o hospedeiro. Este protocolo apresenta um método para interrogar o papel dos metabólitos intestinais no cérebro e no comportamento do rato. Esta técnica fornece um método preciso, meticuloso e validado para entregar metabólitos intestinais em um cérebro em camundongos em movimento livre.
Nós fornecemos uma metodologia abrangente e fisiológica para a melhor visão sobre a pesquisa do eixo do cérebro intestinal. Coloque o mouse sobre o quadro estereotáxico e fixe os incisivos do mouse na barra incisiva no suporte do incisivo estereotáxico. Cubra o nariz com a máscara do cone do nariz.
Em seguida, avalie a nocicepção do rato através do reflexo superior da pinça e garanta uma taxa de respiração constante antes de incidir o local cirúrgico. Uma vez aparado pelo na cabeça é removido pela fita adesiva, por via subcutânea injete o analgésico cetoprofeno para aliviar a dor e aplicar pomada ocular. Em seguida, fixe a cabeça inserindo a barra auricular pontiaguda no canal auditivo.
Aperte o grampo do nariz no suporte do incisivo e pressione a cabeça suavemente para garantir que a cabeça esteja fixa. Use 3 esfoliantes alternados de cotonete de clorexidina para desinfetar o couro cabeludo. Agora, use bisturi dissecante para fazer uma incisão de menos de um centímetro no couro cabeludo de maneira anterior posterior.
Depois de abrir a incisão, limpe o crânio com um cotonete segurado por pinças microdissecantes. Com base nas coordenadas estereotáxicas, identifique e rotule a posição do ventrículo lateral direito conforme descrito no manuscrito. Em seguida, faça um furo através do crânio no local rotulado usando uma broca estereotáxica e, mais tarde, faça mais dois a quatro furos no crânio.
Limpe o crânio com cotonete de lidocaína e monte de 2 a 4 parafusos inoxidáveis nos orifícios. Coloque a cânula guia comercial no suporte da cânula estereotáxica e desinfete com o esterilizador de velocidade de vidro a 150 graus Celsius. Em seguida, mova o suporte da cânula estereotáxica para o orifício perfurado para o ventrículo lateral e insira lentamente a cânula guia comercial no orifício até que a profundidade desejada seja atingida.
Agora aplique 10 microlitros de adesivo de n-butilcianoacrilato para fixar a cânula guia comercial no furo perfurado e aguarde de 3 a 4 minutos. Solte a cânula guia comercial suavemente do suporte da cânula estereotáxica e aplique acrílico dentário no couro cabeludo incisado para fixar a cânula guia comercial e aguarde pelo menos 5 minutos. Implante o manequim comercial na cânula guia comercial.
Em seguida, coloque o rato numa nova gaiola com uma almofada de aquecimento por baixo para recuperação da anestesia e observe continuamente até que o rato acorde completamente. Monte a seringa de microlitro, contendo 10 microlitros de água destilada, na bomba de microinjeção. Usando uma seringa de insulina, encha o tubo de polietileno com água destilada e conecte a seringa de microlitro ao tubo de polietileno suspenso.
Ligue o controlador de microinjeção e pressione Exibir todos os canais para acessar a tela de comando. Em seguida, pressione a configuração e defina a meta de volume para 9.800 nanolitros com taxa de entrega de 100 nanolitros por segundo. Em seguida, pressione a direção para alternar para o modo de infusão e pressione executar para infundir 9.800 nanolitros de água destilada do tubo de polietileno conectado à seringa de microlitro.
Agora, coloque o injetor em um frasco contendo o óleo mineral, pressione a configuração e defina a meta de volume para 3.000 nanolitros com taxa de entrega de 100 nanolitros por segundo. Para retirar 3.000 nanolitros de óleo mineral, pressione a direção para alternar para o modo de retirada e, em seguida, pressione correr. Desmonte o tubo de polietileno da agulha da seringa de microlitro.
Para cuspir 3.000 nanolitros de água destilada da agulha da seringa de microlitro, pressione a direção para alternar para o modo de infusão e pressione correr. Em seguida, insira a seringa de microlitro de volta no tubo de polietileno. Coloque o injetor num frasco para injetáveis contendo AGCC.
Pressione a configuração e defina a meta de volume para 9.500 nanolitros com taxa de entrega de 100 nanolitros por segundo. Retire 9.500 nanolitros de SCFAs pressionando a direção para alternar para o modo de retirada e pressione run. Rotule a fase de SCFAs de óleo para validar se os SCFAs são infundidos com êxito.
Pressione a configuração e defina a meta de volume desejada com taxa de entrega para 7 nanolitros por segundo. Pressione a direção para alternar para o modo de infusão. Pressione correr para infundir a seringa de microlitro para a frente até que o líquido saia na extremidade frontal do injetor comercial antes de inserir o injetor na cânula para injeção de SCFAs.
Depois de anestesiar o rato, introduza o injector comercial na cânula guia comercial. Uma vez que o rato esteja recuperado da anestesia, coloque-o em uma nova gaiola e deixe-o explorar por 35 minutos livremente. Infundir SCFAs usando uma taxa de entrega de 7 nanolitros por segundo para um volume alvo de 2.100 nanolitros nos primeiros 5 minutos.
Em seguida, pressione a direção para o modo de infusão e pressione executar. Após o teste comportamental, remova o injetor comercial da cânula guia comercial. Infundir 2.100 nanolitros do traçador neutro com a taxa de entrega de 7 nanolitros por segundo para verificar o local de infusão.
Fotografe o sinal fluorescente no local de infusão usando um microscópio de fluorescência. Ambos os ratos com infusão de ACSF e SCFAs viajaram em uma nova gaiola por um total de 35 minutos. Não foi observada diferença na atividade locomotora na nova gaiola entre a infusão de AGCCs e SCSF.
O corante fluorescente foi detectado no ventrículo lateral e nas regiões circundantes do cérebro do rato quando infundido com uma cânula guia comercial. Da mesma forma, a infusão através da cânula guia de aço inoxidável leva à detecção de sinais no ventrículo lateral e nas regiões circundantes do cérebro do rato. A combinação deste procedimento com tecnologias neurais baseadas em circuitos permitirá que os cientistas obtenham informações sobre o controle baseado em circuitos do cérebro e o comportamento contribuído pelos metabólitos intestinais.
Esta técnica abre o caminho para os pesquisadores explorarem o papel da microbiota e dos metabólitos no intrincado eixo cerebral intestinal.
