Los metabolitos liberados por la microbiota intestinal producen efectos complejos en el huésped. Este protocolo presenta un método para interrogar el papel de los metabolitos intestinales en el cerebro y el comportamiento del ratón. Esta técnica proporciona un método preciso, meticuloso y validado para administrar metabolitos intestinales en un cerebro en ratones que se mueven libremente.
Proporcionamos una mejor metodología integral y fisiológica para comprender la investigación del eje cerebral intestinal. Coloque el ratón en el marco estereotáxico y fije los incisivos del ratón en la barra incisiva en el soporte del incisivo estereotáxico. Cubra la nariz con la máscara del cono nasal.
Luego evalúe la nocicepción del ratón a través del reflejo de pellizco superior y asegúrese de una frecuencia respiratoria constante antes de incidir el sitio quirúrgico. Una vez que el pelaje recortado en la cabeza se retira con la cinta adhesiva, inyecte por vía subcutánea el analgésico ketoprofeno para aliviar el dolor y aplique ungüento para los ojos. A continuación, fije la cabeza insertando la barra auricular puntiaguda en el canal auditivo.
Apriete la abrazadera nasal en el soporte del incisivo y presione la cabeza suavemente para asegurarse de que la cabeza esté fija. Use 3 exfoliantes alternados de hisopo de clorhexidina para desinfectar el cuero cabelludo. Ahora, use bisturí disecante para hacer una incisión de menos de un centímetro en el cuero cabelludo de manera posterior anterior.
Después de abrir la incisión, limpie el cráneo con un hisopo de algodón sostenido por pinzas de micro disección. Con base en las coordenadas estereotáxicas, identifique y etiquete la posición del ventrículo lateral derecho como se describe en el manuscrito. Luego, perfore un agujero a través del cráneo en el sitio etiquetado con un taladro estereotáxico, y más tarde, perfore de dos a cuatro agujeros más en el cráneo.
Limpie el cráneo con un hisopo de algodón de lidocaína y monte de 2 a 4 tornillos inoxidables en los agujeros. Coloque la cánula de guía comercial en el soporte de cánula estereotáxica y desinfecte con el esterilizador de velocidad de vidrio a 150 grados centígrados. Luego, mueva el soporte de la cánula estereotáxica al orificio perforado para el ventrículo lateral e inserte lentamente la cánula de guía comercial en el orificio hasta que se alcance la profundidad deseada.
Ahora aplique 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato de n-butilo para fijar la cánula de guía comercial en el orificio perforado y espere de 3 a 4 minutos. Suelte la cánula de guía comercial suavemente del soporte de la cánula estereotáxica y aplique acrílico dental en el cuero cabelludo inciso para fijar la cánula de la guía comercial y espere al menos 5 minutos. Implante el maniquí comercial en la cánula de guía comercial.
Luego, coloque al ratón en una nueva jaula con una almohadilla térmica debajo para recuperarse de la anestesia y observe continuamente hasta que el ratón se despierte por completo. Monte la jeringa de microlitros, que contiene 10 microlitros de agua destilada, en la bomba de microinyección. Con una jeringa de insulina, llene el tubo de polietileno con agua destilada y conecte la jeringa de microlitros al tubo de polietileno colgante.
Encienda el controlador de microinyección y pulse mostrar todos los canales para acceder a la pantalla de comandos. A continuación, presione la configuración y establezca el objetivo de volumen en 9, 800 nanolitros con una tasa de entrega de 100 nanolitros por segundo. Luego presione la dirección para cambiar al modo de infusión y presione ejecutar para infundir 9, 800 nanolitros de agua destilada del tubo de polietileno conectado a la jeringa de microlitros.
Ahora, coloque el inyector en un vial que contenga el aceite mineral, presione la configuración y establezca el objetivo de volumen en 3, 000 nanolitros con una tasa de entrega de 100 nanolitros por segundo. Para retirar 3, 000 nanolitros de aceite mineral, presione la dirección para cambiar al modo de extracción y luego presione ejecutar. Desmonte el tubo de polietileno de la aguja de la jeringa de microlitros.
Para escupir 3, 000 nanolitros de agua destilada de la aguja de la jeringa de microlitros, presione la dirección para cambiar al modo de infusión y presione ejecutar. Luego inserte la jeringa de microlitro nuevamente en el tubo de polietileno. Coloque el inyector en un vial que contenga AGCC.
Presione la configuración y establezca el objetivo de volumen en 9, 500 nanolitros con una velocidad de entrega de 100 nanolitros por segundo. Extraiga 9, 500 nanolitros de SCFA presionando la dirección para cambiar al modo de extracción y presione ejecutar. Etiquete la fase de SCFA de aceite para validar si los SCFA se infunden con éxito.
Presione la configuración y establezca el objetivo de volumen deseado con una velocidad de entrega de 7 nanolitros por segundo. Presione la dirección para cambiar al modo de infusión. Presione correr para infundir la jeringa de microlitro hacia adelante hasta que el líquido salga por el extremo frontal del inyector comercial antes de insertar el inyector en la cánula para la inyección de AGCC.
Después de anestesiar el ratón, inserte el inyector comercial en la cánula de guía comercial. Una vez que el ratón se recupere de la anestesia, colóquelo en una jaula novedosa y déjelo explorar durante 35 minutos libremente. Infundir SCFA utilizando una velocidad de entrega de 7 nanolitros por segundo para un volumen objetivo de 2, 100 nanolitros en los primeros 5 minutos.
Luego presione la dirección al modo de infusión y presione ejecutar. Después de las pruebas de comportamiento, retire el inyector comercial de la cánula de la guía comercial. Infundir 2, 100 nanolitros del trazador neutro con la velocidad de entrega de 7 nanolitros por segundo para verificar el sitio de infusión.
Obtener una imagen de la señal fluorescente en el sitio de infusión con un microscopio de fluorescencia. Tanto los ratones infundidos con ACSF como los SCFA viajaron en una jaula novedosa durante un total de 35 minutos. No se observaron diferencias en la actividad locomotora en la nueva jaula entre la infusión de AGCC y el ACSF.
El tinte fluorescente se detectó en el ventrículo lateral y las regiones circundantes del cerebro del ratón cuando se infundió con una cánula guía comercial. Del mismo modo, la infusión a través de la cánula guía de acero inoxidable conduce a la detección de señales en el ventrículo lateral y las regiones circundantes del cerebro del ratón. La combinación de este procedimiento con tecnologías neuronales basadas en circuitos permitirá a los científicos obtener información sobre el control basado en circuitos del cerebro y el comportamiento aportado por los metabolitos intestinales.
Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren el papel de la microbiota y los metabolitos en el intrincado eje cerebral intestinal.
