腸内細菌叢によって放出される代謝産物は、宿主に複雑な影響を及ぼします。このプロトコルは、マウスの脳と行動における腸代謝物の役割を調べる方法を提示します。この技術は、自由に動くマウスの脳に腸代謝物を送達するための正確で綿密で検証された方法を提供します。
私たちは、腸の脳軸研究への洞察のための包括的かつ生理学的な最良の方法論を提供します。マウスを定位固定装置フレームに置き、マウス切歯を定位固定装置用切歯ホルダーの切歯バーに固定します。ノーズコーンマスクで鼻を覆います。
次に、上部ピンチ反射を介してマウスの侵害受容を評価し、手術部位を切開する前に一定の呼吸数を確保します。頭の上のトリミングされた毛皮が粘着テープによって取り除かれたら、痛みを和らげ、目の軟膏を塗るために鎮痛剤ケトプロフェンを皮下注射します。次に、先のとがったイヤーバーを外耳道に挿入して頭を固定します。
切歯ホルダーのノーズクランプを締め、頭をそっと押して頭が固定されていることを確認します。頭皮を消毒するためにクロルヘキシジン綿棒の3つの交互のスクラブを使用してください。次に、解剖メスを使用して、前方後方の頭皮に1センチメートル未満の切開を行います。
切開部を開いた後、微小解剖鉗子で保持した綿棒で頭蓋骨を拭きます。定位固定装置座標に基づいて、原稿に記載されているように右側脳室の位置を特定し、ラベルを付けます。次に、固定装置用ドリルを使用して、ラベル付けされた部位の頭蓋骨に穴を開け、その後、頭蓋骨にさらに2〜4個の穴を開けます。
リドカイン綿棒で頭蓋骨を拭き、穴に2〜4本のステンレスネジを取り付けます。市販のガイドカニューレを定位固定装置用カニューレホルダーに置き、ガラス速度滅菌器で摂氏150度で消毒します。次に、定位固定装置カニューレホルダーを側脳室用に開けられた穴に移動し、目的の深さに達するまで市販のガイドカニューレを穴にゆっくりと挿入します。
次に、10マイクロリットルのn-ブチルシアノアクリレート接着剤を塗布して、市販のガイドカニューレをドリル穴に固定し、3〜4分間待ちます。市販のガイドカニューレを定位固定装置用カニューレホルダーからそっと解放し、切開した頭皮に歯科用アクリルを塗布して市販のガイドカニューレを固定し、少なくとも5分間待ちます。市販のダミーを市販のガイドカニューレに埋め込みます。
次に、麻酔からの回復のために、下に加熱パッドが付いた新しいケージにマウスを置き、マウスが完全に目覚めるまで観察し続けます。10マイクロリットルの蒸留水を含むマイクロリットルシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付けます。インスリン注射器を使用して、ポリエチレンチューブに蒸留水を満たし、マイクロリットルシリンジを吊り下げポリエチレンチューブに接続します。
マイクロインジェクションコントローラーの電源を入れ、すべてのチャンネルを表示を押してコマンド画面にアクセスします。次に、構成を押して、ボリューム目標を毎秒100ナノリットルの配信速度で9, 800ナノリットルに設定します。次に、方向を押して注入モードに切り替え、実行を押して、マイクロリットルシリンジに接続されたポリエチレンチューブから9, 800ナノリットルの蒸留水を注入します。
次に、インジェクターを鉱油を含むバイアルに入れ、構成を押して、体積目標を3, 000ナノリットルに設定し、送達速度を毎秒100ナノリットルに設定します。3, 000ナノリットルの鉱油を引き出すには、方向を押して撤回モードに切り替えてから、実行を押します。ポリエチレンチューブをマイクロリットルシリンジ針から分解します。
マイクロリットルのシリンジ針から3, 000ナノリットルの蒸留水を吐き出すには、方向を押して注入モードに切り替え、実行を押します。次に、マイクロリットルのシリンジをポリエチレンチューブに戻します。インジェクターをSCFAを含むバイアルに入れます。
構成を押して、ボリューム目標を9, 500ナノリットルに設定し、配信速度を毎秒100ナノリットルに設定します。方向を押して撤回モードに切り替えて実行を押して、9, 500ナノリットルのSCFAを引き出します。オイルSCFA相にラベルを付けて、SCFAが正常に注入されたかどうかを検証します。
構成を押して、配信速度で目的のボリュームターゲットを7ナノリットル/秒に設定します。方向を押して注入モードに切り替えます。SCFA注射用のカニューレにインジェクターを挿入する前に、市販のインジェクターの前端に液体が出るまで、実行を押してマイクロリットルのシリンジを前方に注入します。
マウスに麻酔をかけた後、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレに挿入します。マウスが麻酔から回復したら、新しいケージに入れ、35分間自由に探索します。最初の5分間で2, 100ナノリットルの目標体積に対して毎秒7ナノリットルの送達速度を使用してSCFAを注入する。
次に、方向を押して注入モードにし、実行を押します。動作テストの後、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレから取り外します。注入部位を確認するために、毎秒7ナノリットルの送達速度で2, 100ナノリットルの中性トレーサーを注入する。
蛍光顕微鏡を使用して注入部位の蛍光シグナルを画像化します。ACSFおよびSCFAを注入したマウスの両方が、新規ケージ内で合計35分間移動した。新規ケージの自発運動活動は、SCFAの注入とACSFの間で観察されませんでした。.
蛍光色素は、市販のガイドカニューレを注入したときにマウス脳の側脳室および周辺領域で検出された。同様に、ステンレス鋼ガイドカニューレを介した注入は、側脳室およびマウス脳の周辺領域における信号の検出をもたらす。この手順を回路ベースの神経技術と組み合わせることで、科学者は脳の回路ベースの制御と腸代謝物によってもたらされる行動についての洞察を得ることができます。
この技術は、研究者が複雑な腸の脳軸における微生物叢と代謝物の役割を探求するための道を開きます。
