Die Insulinresistenz kann in primären Adipozyten untersucht werden, was die Untersuchung von Spendern in verschiedenen physiopathologischen Kontexten ermöglicht, wie z. B. mager oder fettleibig oder Zellen aus verschiedenen Fettdepots. Primäre Adipozyten behalten viele ihrer intrinsischen Eigenschaften bei und können unter definierten Bedingungen über einen langen Zeitraum kultiviert werden, wobei zelluläre Umweltfaktoren streng kontrolliert werden. Um den Differenzierungsprozess zu starten, müssen die Zellen eine Konfluenz von 80 % aufweisen.
Beginnt die Differenzierung bei einer niedrigeren oder höheren Konfluenz, differenzieren sich die Zellen weniger oder verlieren ihre Differenzierungsfähigkeit. Desinfizieren Sie die Mäuse nach der Tötung des Tieres, indem Sie sie mit 70%igem Ethanol einreiben. Sezieren Sie das subkutane Fettgewebe der Leistenhaut von jeder Maus und sammeln Sie es in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen, das 15 Milliliter Kollagenaselösung vom Typ 1 auf Eis enthält.
Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere in kleine Stücke und verdauen Sie die Proben durch Inkubation mit Kollagenaselösung vom Typ 1 bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler bei 150 U/min für 30 Minuten. Überprüfen Sie die Verdauung alle 10 Minuten, um sicherzustellen, dass sie funktioniert, und um eine Überverdauung zu vermeiden. Filtern Sie mit einer 200-Mikrometer-Netzspritze, um das nicht mit Kollagenase verdaute Gewebe zu entfernen, und führen Sie den Filter über den Rand des Röhrchens, um so viele Zellen wie möglich in die Lösung zu entwässern.
Fügen Sie 15 Milliliter kaltes DMEM 1%BSA hinzu, um die Verdauung zu stoppen, und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 400 G bei vier Grad Celsius. Saugen Sie die oberste Schicht mit reifen Adipozyten und den größten Teil der Flüssigkeitsschicht ab. Fügen Sie 20 Milliliter kaltes PBS 2%FBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet.
Nachdem Sie erneut fünf Minuten lang zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand, indem Sie die obere Schicht absaugen, um die verbleibenden Adipozyten und das Fett zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter ACK-Lysepuffer. Fünf Minuten auf Eis inkubieren.
Fügen Sie 10 Milliliter PBS 2% FBS hinzu und mischen Sie es. Nachdem Sie fünf Minuten lang zentrifugiert und den Überstand abgesaugt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Anti-FC-Lösung. Inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen, das in die vorgekühlten Racks eines Magnetzellenseparators passt.
Nachdem Sie fünf Minuten lang zentrifugiert und den Überstand entfernt haben, fügen Sie 200 Mikroliter der Mischung aus monoklonalem Antikörper CD 31 Biotin und monoklonalem Antikörper CD 45 Biotin hinzu. Gut mischen und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Dann 400 Mikroliter PBS 2%FBS zugeben und erneut bei 400 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Saugen Sie den Überstand ab und inkubieren Sie ihn in 100 Mikrolitern Anti-Biotin-Mikrokügelchen 15 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie 400 Mikroliter PBS 2%FBS hinzu und zentrifugieren Sie erneut bei 400 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 350 Mikrolitern PBS 2%FBS.
Um die Zellaggregate oder große Partikel aus den einzelnen Zellsuspensionen mit einem 70-Mikrometer-Vorabscheidefilter zu entfernen, aktivieren Sie den Filter mit 100 Mikrolitern PBS 2%FBS. Führen Sie die Zellsuspension durch den Filter und sammeln Sie sie in einem sauberen Röhrchen. Waschen Sie dann den Filter mit 100 Mikrolitern PBS 2%FBS.
Um eine magnetische Trennung von Zellen mit der negativen Trennstrategie durchzuführen, platzieren Sie die Probe in Position A des gekühlten Racks und zwei leere Röhrchen in den Positionen B und C, um die nicht markierten und markierten Zellen zu gewinnen. Anschließend Waschpuffer und Laufpuffer in die entsprechenden Flaschen füllen. Wählen Sie im Abschnitt "Trennung" die Anzahl der zu trennenden Proben aus und wählen Sie das Erschöpfungsprotokoll aus.
Drücken Sie auf Ausführen und starten Sie die Trennung. Stellen Sie am Ende des Programms die unbeschrifteten Zellen wieder her. Beschichten Sie als Nächstes eine 12-Well-Platte mit einer Basalmembranmatrix, indem Sie 400 Mikroliter 2,5%-Basalmembranmatrix hinzufügen, um die gesamte Oberfläche jedes Wells abzudecken.
Entfernen Sie die überschüssige Lösung und lassen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang in der Laminar-Flow-Haube trocknen. Nachdem Sie fünf Minuten lang zentrifugiert und den Überstand entsorgt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Wachstumsmedium. Säen Sie die Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) in eine Vertiefung der 12-Well-Platte, die zuvor mit einer 2,5%igen Basalmembranmatrix beschichtet wurde.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen. Nachdem Sie das Medium vollständig entfernt haben, waschen Sie die Zellen mit 350 Mikrolitern PBS 2%FBS. Ernten Sie die Zellen mit 350 Mikrolitern 0,05%Tripsin EDTA für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius und fügen Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzu.
Die Zellen werden in einem neuen konischen 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt und fünf Minuten lang bei 400 G zentrifugiert. Die APCs werden zu 12-Well-Platten geleitet, die zuvor mit einer 2,5%igen Basalmembranmatrix beschichtet waren, und bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
Bei einer Konfluenz von 80 % wird ein beliebiges Wachstumsmedium abgesaugt und durch 500 Mikroliter Differenzierungsmedium ersetzt, das in jeder Vertiefung 3,3 nanomolare knochenmorphogenetisches Protein enthält. Ersetzen Sie nach 48 Stunden das Medium durch 500 Mikroliter pro Well-Differenzierungsmedium und den Differenzierungscocktail. Entfernen Sie das Medium 72 Stunden später und geben Sie 100 Nanomolar Insulin in 500 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium.
Induzieren Sie 48 Stunden später eine Insulinresistenz mit vier Nanogramm pro Milliliter Tumornekrosefaktor alpha oder TNF alpha. Saugen Sie ein beliebiges Differenzierungsmedium ab und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter einfaches Medium 2%FBS mit TNF alpha. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden werden vier Nanogramm TNF alpha pro Milliliter in einem einfachen mittleren 0%FBS zugegeben.
Aktivieren Sie den Insulin-Signalweg 24 Stunden später durch Zugabe von 100 nanomolaren Insulin und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre, wie bereits gezeigt. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie es mit 500 Mikrolitern PBS, einschließlich einer Kontrollmulde ohne Insulinbehandlung. Proteinextraktion und Messung der Phosphorylierung von Insulin-Signalmarkern mittels Western Blot.
Subkutane Adipozyten-Vorläuferzellen bei 80%Konfluenz vor der Induktion der Differenzierung in den 12-Well-Kulturplatten und primäre Adipozyten nach sieben Tagen der Induktionsdifferenzierung sind in dieser Abbildung dargestellt. Die durch TNF alpha induzierte Insulinresistenz in subkutanen primären Adipozyten wurde durch eine verminderte Insulin-induzierte Phosphorylierung des Insulinrezeptors, des Insulinrezeptorsubstrats und der Proteinkinase B oder AKT nachgewiesen. Die Membran wurde mit anti-phosphoryliertem Insulinrezeptor, anti-phosphoryliertem Insulinrezeptorsubstrat eins, anti-phosphoryliertem AKT und Anti-Beta-Tubulin als Beladungskontrolle untersucht.
Das Signal wurde mittels Chemilumineszenz-Detektion visualisiert. Die repräsentativen Blots und die Quantifizierung aus drei unabhängigen Experimenten sind hier dargestellt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens muss darauf geachtet werden, dass die Induktion einer Insulinresistenz mit TNF alpha mit 2 % FBS für 24 Stunden und mit 0 % FBS für die letzten 24 Stunden erfolgt.
