La resistenza all'insulina può essere valutata negli adipociti primari, consentendo lo studio di donatori in diversi contesti fisiopatologici, come magri contro obesi, o cellule provenienti da diversi depositi di grasso. Gli adipociti primari conservano molte delle loro proprietà intrinseche e possono essere coltivati in condizioni definite per un lungo periodo di tempo, con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari. Per avviare il processo di differenziazione, le cellule devono essere all'80% di confluenza.
Se la differenziazione inizia a una confluenza inferiore o superiore, le cellule si differenziano meno o perdono la loro capacità di differenziazione. Dopo aver sacrificato l'animale, disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70%. Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo inguinale da ciascun topo e raccoglierlo in un tubo conico da 15 millilitri, contenente 15 millilitri di soluzione di collagenasi di tipo uno su ghiaccio.
Tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi con forbici chirurgiche sterili e digerire i campioni mediante incubazione con soluzione di collagenasi di tipo uno a 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale a 150 RPM per 30 minuti. Controlla la digestione ogni 10 minuti per assicurarti che funzioni e per prevenire la digestione eccessiva. Filtrare utilizzando una siringa a maglia da 200 micrometri per eliminare il tessuto non digerito con collagenasi e passare il filtro oltre il bordo del tubo per drenare il maggior numero possibile di cellule nella soluzione.
Aggiungere 15 millilitri di DMEM 1% BSA freddo per fermare la digestione e centrifugare a 400 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare lo strato superiore contenente adipociti maturi e la maggior parte dello strato liquido. Aggiungere 20 millilitri di PBS freddo 2% FBS e risospendere il pellet.
Dopo aver centrifugato nuovamente per cinque minuti, rimuovere il surnatante aspirando lo strato superiore per eliminare gli adipociti e il grasso rimanenti. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisa ACK. Incubare sul ghiaccio per cinque minuti.
Aggiungere 10 millilitri di PBS 2% FBS e mescolare. Dopo aver centrifugato per cinque minuti e aspirato il surnatante, risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione anti-FC. Incubare su ghiaccio per cinque minuti e trasferire la sospensione cellulare su un tubo da cinque millilitri che si inserisce nei rack pre-refrigerati di un separatore di celle magnetico.
Dopo aver centrifugato per cinque minuti ed eliminato il surnatante, aggiungere 200 microlitri della miscela di biotina anticorpo monoclonale CD 31 e biotina anticorpo monoclonale CD 45. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi aggiungere 400 microlitri di PBS 2% FBS e centrifugare nuovamente a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e incubarlo in 100 microlitri di microsfere anti-biotina per 15 minuti su ghiaccio. Aggiungere 400 microlitri di PBS 2% FBS e centrifugare nuovamente a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, come mostrato in precedenza. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 350 microlitri di PBS 2% FBS.
Per rimuovere gli aggregati cellulari, o particelle di grandi dimensioni, dalle sospensioni a cella singola con un filtro di pre-separazione a 70 micrometri, attivare il filtro con 100 microlitri di PBS 2% FBS. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro e raccoglierla in un tubo pulito. Quindi lavare il filtro con 100 microlitri di PBS 2% FBS.
Per eseguire la separazione magnetica delle celle utilizzando la strategia di separazione negativa, posizionare il campione nella posizione A del rack refrigerato e due tubi vuoti nelle posizioni B e C per recuperare le celle non marcate ed etichettate. Quindi caricare il tampone di lavaggio e il buffer di esecuzione nelle bottiglie corrispondenti. Nella sezione di separazione, selezionare il numero di campioni da separare e selezionare il protocollo di esaurimento.
Premere Esegui e avviare la separazione. Alla fine del programma, recuperare le celle non etichettate. Successivamente, rivestire una piastra a 12 pozzetti con matrice di membrana basale aggiungendo 400 microlitri di matrice di membrana seminterrato al 2,5% per coprire l'intera superficie di ciascun pozzetto.
Rimuovere la soluzione in eccesso e lasciare asciugare la piastra all'interno della cappa a flusso laminare per almeno un'ora. Dopo aver centrifugato per cinque minuti e scartato il surnatante, risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno di coltura. Seminare le cellule precursori degli adipociti, o APC, in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita con una matrice di membrana basale del 2,5%.
Incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% e cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza. Dopo aver rimosso completamente il mezzo, lavare le celle con 350 microlitri di PBS 2% FBS. Raccogliere le cellule con 350 microlitri di 0,05% tripsina EDTA per due minuti a 37 gradi Celsius e aggiungere due millilitri di terreno di crescita.
Raccogliere le cellule in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 400 G per cinque minuti. Far passare gli APC su piastre a 12 pozzetti, precedentemente rivestiti con una matrice a membrana basale del 2,5%, e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
All'80% di confluenza, aspirare qualsiasi mezzo di crescita e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo di differenziazione, contenente 3,3 proteine morfogenetiche ossee nanomolari in ciascun pozzetto. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con 500 microlitri per mezzo di differenziazione del pozzetto e il cocktail di differenziazione. Rimuovere il terreno 72 ore dopo e aggiungere 100 nanomolari di insulina in 500 microlitri di terreno di differenziazione fresco.
48 ore dopo, indurre insulino-resistenza con quattro nanogrammi per millilitro di fattore di necrosi tumorale alfa, o TNF alfa. Aspirare qualsiasi mezzo di differenziazione e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo semplice 2% FBS con TNF alfa. Dopo l'incubazione per 24 ore, aggiungere quattro nanogrammi per millilitro di TNF alfa in un mezzo semplice 0% FBS.
Attivare la via di segnalazione dell'insulina 24 ore dopo aggiungendo 100 insulina nanomolare e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%, come mostrato in precedenza. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo e lavare con 500 microlitri di PBS, includere un pozzo di controllo senza il trattamento insulinico. Estrarre proteine e misurare la fosforilazione dei marcatori di segnalazione dell'insulina mediante Western blot.
In questa figura sono mostrate le cellule precursori degli adipociti sottocutanei all'80% prima di indurre la differenziazione nelle piastre di coltura a 12 pozzetti e gli adipociti primari dopo sette giorni dall'induzione della differenziazione. La resistenza all'insulina indotta dal TNF alfa negli adipociti primari sottocutanei è stata dimostrata da una diminuzione della fosforilazione indotta dall'insulina del recettore dell'insulina, del substrato del recettore dell'insulina e della proteina chinasi B o AKT. La membrana è stata sondata con recettore dell'insulina anti-fosforilato, substrato del recettore dell'insulina anti-fosforilato uno, AKT anti-fosforilato e tubulina anti-beta è stata utilizzata come controllo del carico.
Il segnale è stato visualizzato con rilevamento a chemiluminescenza. Le macchie rappresentative e la quantificazione di tre esperimenti indipendenti sono mostrate qui. Quando si tenta questa procedura, una cosa che deve essere curata è che l'induzione della resistenza all'insulina con TNF alfa è con 2% FBS per 24 ore e con 0% FBS per le ultime 24 ore.
