La résistance à l’insuline peut être évaluée dans les adipocytes primaires, ce qui permet d’étudier des donneurs dans différents contextes physiopathologiques, tels que maigre versus obèse, ou des cellules provenant de différents dépôts graisseux. Les adipocytes primaires conservent bon nombre de leurs propriétés intrinsèques et peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant une longue période, avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires. Pour démarrer le processus de différenciation, les cellules doivent être à 80% de confluence.
Si la différenciation commence à une confluence plus ou moins élevée, les cellules se différencient moins ou perdront leur capacité de différenciation. Après avoir sacrifié l’animal, désinfectez les souris en frottant avec de l’éthanol à 70%. Disséquez le tissu adipeux sous-cutané inguinal de chaque souris et recueillez-le dans un tube conique de 15 millilitres, contenant 15 millilitres de solution de collagénase de type un sur de la glace.
Couper le tissu adipeux en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux stériles et digérer les échantillons par incubation avec une solution de collagénase de type un à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital à 150 RPM pendant 30 minutes. Vérifiez la digestion toutes les 10 minutes pour vous assurer qu’elle fonctionne et pour éviter la surdigestion. Filtrez à l’aide d’une seringue à mailles de 200 micromètres pour éliminer le tissu non digéré avec la collagénase, et passez le filtre sur le bord du tube pour drainer autant de cellules que possible dans la solution.
Ajouter 15 millilitres de DMEM froid 1% BSA pour arrêter la digestion, et centrifuger à 400 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer la couche supérieure contenant les adipocytes matures et la majeure partie de la couche liquide. Ajoutez 20 millilitres de PBS froid à 2% FBS et remettez la pastille en suspension.
Après avoir centrifugé à nouveau pendant cinq minutes, retirez le surnageant en aspirant la couche supérieure pour éliminer les adipocytes et les graisses restants. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon lysant ACK. Incuber sur la glace pendant cinq minutes.
Ajoutez 10 millilitres de PBS 2% FBS et mélangez-le. Après avoir centrifugé pendant cinq minutes et aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de solution anti-FC. Incuber sur de la glace pendant cinq minutes et transférer la suspension cellulaire dans un tube de cinq millilitres qui s’insère dans les racks pré-refroidis d’un séparateur de cellules magnétiques.
Après avoir centrifugé pendant cinq minutes et éliminé le surnageant, ajoutez-y 200 microlitres du mélange d’anticorps monoclonaux biotine CD 31 et d’anticorps monoclonal CD-45. Bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite 400 microlitres de PBS 2% FBS et centrifugez à nouveau à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirez le surnageant et incuberez-le dans 100 microlitres de microbilles anti-biotine pendant 15 minutes sur de la glace. Ajouter 400 microlitres de PBS 2% FBS et centrifuger à nouveau à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, comme indiqué précédemment. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille dans 350 microlitres de PBS 2%FBS.
Pour éliminer les agrégats cellulaires, ou grosses particules, des suspensions monocellulaires avec un filtre de pré-séparation de 70 micromètres, activez le filtre avec 100 microlitres de PBS 2%FBS. Passez la suspension cellulaire à travers le filtre et recueillez-la dans un tube propre. Lavez ensuite le filtre avec 100 microlitres de PBS 2%FBS.
Pour effectuer la séparation magnétique des cellules en utilisant la stratégie de séparation négative, placez l’échantillon dans la position A de la grille réfrigérée et deux tubes vides dans les positions B et C pour récupérer les cellules non marquées et marquées. Ensuite, chargez le tampon de lavage et le tampon de passage dans les bouteilles correspondantes. Dans la section séparation, sélectionnez le nombre d’échantillons à séparer et sélectionnez le protocole d’épuisement.
Appuyez sur exécuter et démarrez la séparation. À la fin du programme, récupérez les cellules non étiquetées. Ensuite, enduisez une plaque de 12 puits avec une matrice membranaire basale en ajoutant 400 microlitres de matrice membranaire de base à 2,5% pour couvrir toute la surface de chaque puits.
Retirez l’excès de solution et laissez la plaque sécher à l’intérieur de la hotte à flux laminaire pendant au moins une heure. Après avoir centrifugé pendant cinq minutes et jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de milieu de croissance. Ensemencer les cellules précurseurs des adipocytes, ou APC, dans un puits de la plaque de 12 puits préalablement recouverte d’une matrice membranaire basale à 2,5 %.
Incuber à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5% et changer le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence. Après avoir complètement retiré le milieu, lavez les cellules avec 350 microlitres de PBS 2%FBS. Récoltez les cellules avec 350 microlitres de 0,05% de trip dans l’EDTA pendant deux minutes à 37 degrés Celsius, et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance.
Recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et centrifuger à 400 g pendant cinq minutes. Passer les APC sur des plaques à 12 puits, préalablement recouvertes d’une matrice membranaire de base à 2,5 %, et incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
À 80% de confluence, aspirer tout milieu de croissance et le remplacer par 500 microlitres de milieu de différenciation, contenant 3,3 nanomolaires protéines morphogénétiques osseuses dans chaque puits. Après 48 heures, remplacer le milieu par 500 microlitres par milieu de différenciation de puits, et le cocktail de différenciation. Retirez le milieu 72 heures plus tard et ajoutez 100 nanomolaires d’insuline dans 500 microlitres de milieu de différenciation frais.
48 heures plus tard, induire une résistance à l’insuline avec quatre nanogrammes par millilitre de facteur de nécrose tumorale alpha, ou TNF alpha. Aspirez tout milieu de différenciation et remplacez-le par 500 microlitres de milieu simple 2%FBS avec TNF alpha. Après avoir incubé pendant 24 heures, ajouter quatre nanogrammes par millilitre de TNF alpha dans un milieu simple 0%FBS.
Activez la voie de signalisation de l’insuline 24 heures plus tard en ajoutant 100 nanomolaires d’insuline et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5%, comme indiqué précédemment. Après l’incubation, retirer le milieu et laver avec 500 microlitres de PBS, inclure un puits de contrôle sans le traitement à l’insuline. Extraire les protéines et mesurer la phosphorylation des marqueurs de signalisation de l’insuline par transfert Western.
Les cellules précurseurs adipocytaires sous-cutanées à 80% de confluence avant d’induire la différenciation dans les plaques de culture à 12 puits, et les adipocytes primaires après sept jours d’induction de la différenciation sont représentés dans cette figure. La résistance à l’insuline induite par le TNF alpha dans les adipocytes primaires sous-cutanés a été démontrée par une diminution de la phosphorylation induite par l’insuline du récepteur de l’insuline, du substrat un du récepteur de l’insuline et de la protéine kinase B ou AKT. La membrane a été sondée avec un récepteur d’insuline anti-phosphorylé, un substrat de récepteur de l’insuline anti-phosphorylé, un AKT anti-phosphorylé, et la tubuline anti-bêta a été utilisée comme contrôle de charge.
Le signal a été visualisé avec détection par chimiluminescence. Les taches représentatives et la quantification de trois expériences indépendantes sont présentées ici. Lors de la tentative de cette procédure, une chose qui doit être prise en compte est que l’induction de la résistance à l’insuline avec TNF alpha est avec 2% FBS pendant 24 heures et avec 0% FBS pour les dernières 24 heures.
