인슐린 저항성은 원발성 지방 세포에서 평가할 수 있으며, 이를 통해 제지방 대 비만과 같은 다양한 생리병리학적 맥락에서 기증자 또는 다른 지방 침착의 세포를 연구할 수 있습니다. 일차 지방세포는 많은 고유 특성을 유지하며 세포 환경 요인을 엄격하게 제어하면서 정의된 조건에서 장기간 배양할 수 있습니다. 분화 과정을 시작하려면 세포가 80%합류해야 합니다.
분화가 더 낮거나 더 높은 합류점에서 시작되면 세포는 덜 분화하거나 분화 능력을 잃게 됩니다. 동물을 희생 한 후 70 % 에탄올로 문질러 생쥐를 소독하십시오. 각 마우스에서 사타구니 피하 지방 조직을 해부하고 얼음 위에 15 밀리리터의 1 형 콜라게나제 용액이 들어있는 15 밀리리터의 원추형 튜브에 수집합니다.
멸균 수술용 가위로 지방 조직을 작은 조각으로 절단하고 섭씨 37도의 오비탈 셰이커에서 150RPM의 1형 콜라게나제 용액으로 30분 동안 배양하여 샘플을 분해합니다. 10분마다 소화가 작동하는지 확인하고 소화가 과도하지 않도록 확인하십시오. 200마이크로미터 메쉬 주사기를 사용하여 여과하여 콜라게나제로 분해되지 않은 조직을 제거하고 필터를 튜브 가장자리에 통과시켜 가능한 한 많은 세포를 용액으로 배출합니다.
소화를 멈추기 위해 차가운 DMEM 1% BSA 15밀리리터를 추가하고 섭씨 4도에서 10분 동안 400G에서 원심분리합니다. 성숙한 지방 세포와 대부분의 액체 층을 포함하는 최상층을 흡인합니다. 차가운 PBS 20%FBS 2밀리리터를 추가하고 펠릿을 다시 현탁합니다.
다시 5분 동안 원심분리한 후, 상층을 흡인하여 상층액을 제거하여 잔류 지방세포와 지방을 제거한다. 펠릿을 1밀리리터의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다. 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오.
PBS 2%FBS 10밀리리터를 넣고 섞는다. 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인한 후, 펠릿을 200 마이크로리터의 항-FC 용액에 재현탁시킨다. 5분 동안 얼음 위에서 배양하고 세포 현탁액을 자기 세포 분리기의 사전 냉각 랙에 맞는 5밀리리터 튜브로 옮깁니다.
5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 제거한 후, CD 31 단일 클론 항체 비오틴과 CD 45 단일 클론 항체 비오틴의 혼합물 200 마이크로 리터를 첨가한다. 잘 섞고 얼음에서 15 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 400 마이크로 리터의 PBS 2 % FBS를 넣고 섭씨 4도에서 5 분 동안 400G에서 다시 원심 분리합니다.
상층액을 흡인하고 얼음 위에서 15분 동안 100마이크로리터의 항비오틴 마이크로비드에서 배양합니다. 400마이크로리터의 PBS 2%FBS를 추가하고 이전에 표시된 대로 섭씨 4도에서 5분 동안 400G에서 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 펠릿을 350 마이크로리터의 PBS 2%FBS에 재현탁시킨다.
70마이크로미터 사전 분리 필터로 단일 세포 현탁액에서 세포 응집체 또는 큰 입자를 제거하려면 100마이크로리터의 PBS 2%FBS로 필터를 활성화합니다. 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시키고 깨끗한 튜브에 모으십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 PBS 2%FBS로 필터를 세척합니다.
네거티브 분리 전략을 사용하여 셀의 자기 분리를 수행하려면 샘플을 냉각 랙의 위치 A에 배치하고 위치 B와 C에 두 개의 빈 튜브를 배치하여 라벨링되지 않은 및 라벨링된 셀을 회수합니다. 그런 다음 세척 버퍼와 실행 버퍼를 해당 병에 넣습니다. 분리 섹션에서 분리할 샘플 수를 선택하고 고갈 프로토콜을 선택합니다.
실행을 누르고 분리를 시작합니다. 프로그램이 끝나면 레이블이 지정되지 않은 셀을 복구합니다. 다음으로, 각 웰의 전체 표면을 덮기 위해 400 마이크로리터의 2.5% 기저막 매트릭스를 첨가하여 12-웰 플레이트를 기저막 매트릭스로 코팅한다.
과잉 용액을 제거하고 플레이트를 층류 후드 내부에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다. 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버린 후, 펠릿을 500 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁시킨다. 이전에 2.5% 기저막 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트의 한 웰에 지방 세포 전구체 세포(APC)를 시드합니다.
섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 대기에서 배양하고 세포가 80 % 합류에 도달 할 때까지 48 시간마다 배지를 교체합니다. 배지를 완전히 제거한 후, 세포를 350 마이크로리터의 PBS 2%FBS로 세척한다. 섭씨 37도에서 2 분 동안 350 마이크로 리터의 0.05 % 트립 신 EDTA로 세포를 수확하고 2 밀리리터의 성장 배지를 첨가한다.
새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브에 세포를 수집하고 400G에서 5분 동안 원심분리합니다. APC를 이전에 2.5% 기저막 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트에 통과시키고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체하십시오.
80% 합류에서 성장 배지를 흡인하고 각 웰에 3.3나노몰 뼈 형태 형성 단백질을 포함하는 500마이크로리터의 분화 배지로 교체합니다. 48시간 후, 배지를 분화 배지 및 분화 칵테일 웰 당 500 마이크로리터로 교체한다. 72시간 후에 배지를 제거하고, 500 마이크로리터의 신선한 분화 배지에 100 나노몰의 인슐린을 첨가한다.
48시간 후, 종양 괴사 인자 알파 또는 TNF 알파 밀리리터당 4나노그램으로 인슐린 저항성을 유도합니다. 분화 배지를 흡인하고 TNF 알파가 있는 500마이크로리터의 단순 배지 2%FBS로 교체합니다. 24시간 동안 배양한 후 단순 배지 0%FBS에 TNF 알파 밀리리터당 4나노그램을 추가합니다.
24시간 후 100나노몰 인슐린을 첨가하여 인슐린 신호전달 경로를 활성화하고 앞서 설명한 바와 같이 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 분위기에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 500 마이크로리터의 PBS로 세척하고, 인슐린 처리 없이 대조군 웰을 포함시켰다. 단백질을 추출하고 인슐린 신호전달 마커의 인산화를 웨스턴 블랏으로 측정하였다.
12-웰 배양 플레이트에서 분화를 유도하기 전 80% 합류 지점의 피하 지방세포 전구세포와 분화 유도 7일 후의 일차 지방세포를 본 그림에 나타내었다. 피하 원발성 지방세포에서 TNF 알파에 의해 유도된 인슐린 저항성은 인슐린 수용체, 인슐린 수용체 기질 1 및 단백질 키나아제 B 또는 AKT의 인슐린 유도 인산화 감소에 의해 입증되었다. 멤브레인은 항-인산화 인슐린 수용체, 항-인산화 인슐린 수용체 기질, 항-인산화 AKT, 및 항-베타 튜불린을 로딩 대조군으로 사용하여 프로브하였다.
신호는 화학발광 검출로 시각화되었습니다. 대표적인 블롯 및 3개의 독립적인 실험으로부터의 정량화가 여기에 도시되어 있다. 이 절차를 시도할 때 주의해야 할 한 가지는 TNF 알파를 사용한 인슐린 저항성 유도가 24시간 동안 2% FBS로, 마지막 24시간 동안 0% FBS로 유도된다는 것입니다.
