A resistência insulínica pode ser avaliada em adipócitos primários, permitindo o estudo de doadores sob diferentes contextos fisiopatológicos, como magros versus obesos, ou células de diferentes depósitos de gordura. Os adipócitos primários mantêm muitas de suas propriedades intrínsecas e podem ser cultivados sob condições definidas por um longo período de tempo, com um controle rigoroso dos fatores ambientais celulares. Para iniciar o processo de diferenciação, as células devem estar a 80% de confluência.
Se a diferenciação começa em uma confluência menor ou maior, as células se diferenciarão menos ou perderão sua capacidade de diferenciação. Após sacrificar o animal, desinfete os camundongos esfregando com etanol 70%. Dissecar o tecido adiposo subcutâneo inguinal de cada camundongo e coletá-lo em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo 15 mililitros de solução de colagenase tipo um sobre gelo.
Cortar o tecido adiposo em pequenos pedaços com tesoura cirúrgica estéril e digerir as amostras por incubação com solução de colagenase tipo um a 37 graus Celsius em um agitador orbital a 150 RPM por 30 minutos. Verifique a digestão a cada 10 minutos para garantir que funcione e evitar a digestão excessiva. Filtrar usando uma seringa de malha de 200 micrômetros para eliminar o tecido não digerido com colagenase e passar o filtro sobre a borda do tubo para drenar o maior número possível de células para a solução.
Adicione 15 mililitros de DMEM 1% BSA frio para interromper a digestão e centrifugar a 400 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Aspirar a camada superior contendo adipócitos maduros e a maior parte da camada líquida. Adicione 20 mililitros de PBS 2% FBS frio e ressuspenda o pellet.
Após centrifugar novamente por cinco minutos, retirar o sobrenadante aspirando a camada superior para eliminar os adipócitos e gordura restantes. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão lisante ACK. Incubar no gelo por cinco minutos.
Adicione 10 mililitros de PBS 2% FBS e misture. Após centrifugar por cinco minutos e aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 200 microlitros de solução anti-FC. Incubar no gelo por cinco minutos e transferir a suspensão celular para um tubo de cinco mililitros que se encaixa nos racks pré-resfriados de um separador magnético de células.
Após centrifugar por cinco minutos e eliminar o sobrenadante, adicionar 200 microlitros da mistura de biotina do anticorpo monoclonal CD 31 e biotina do anticorpo monoclonal CD 45. Misture bem e incube no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione 400 microlitros de PBS 2% FBS e centrifugar novamente a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspirar o sobrenadante e incubá-lo em 100 microlitros de microesferas anti-biotina por 15 minutos no gelo. Adicione 400 microlitros de PBS 2% FBS e centrifugar novamente a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius, como mostrado anteriormente. Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 350 microlitros de PBS 2% FBS.
Para remover os agregados celulares, ou partículas grandes, das suspensões de célula única com um filtro de pré-separação de 70 micrômetros, ative o filtro com 100 microlitros de PBS 2% FBS. Passe a suspensão da célula através do filtro e colete-a em um tubo limpo. Em seguida, lave o filtro com 100 microlitros de PBS 2%FBS.
Para realizar a separação magnética das células utilizando a estratégia de separação negativa, coloque a amostra na posição A do rack refrigerado e dois tubos vazios nas posições B e C para recuperar as células não marcadas e marcadas. Em seguida, carregue o tampão de lavagem e o tampão de execução nos frascos correspondentes. Na seção de separação, selecione o número de amostras a serem separadas e selecione o protocolo de esgotamento.
Pressione executar e inicie a separação. No final do programa, recupere as células não marcadas. Em seguida, revestir uma placa de 12 poços com matriz de membrana basal adicionando 400 microlitros de matriz de membrana basal de 2,5% para cobrir toda a superfície de cada poço.
Retire o excesso de solução e deixe a placa secar dentro da capela de fluxo laminar por pelo menos uma hora. Após centrifugar por cinco minutos e descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 500 microlitros de meio de cultura. Semeando as células precursoras dos adipócitos, ou APCs, em um poço da placa de 12 poços previamente revestida com matriz de membrana basal de 2,5%.
Incubar a 37 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% e trocar o meio a cada 48 horas até que as células atinjam 80% de confluência. Depois de remover completamente o meio, lave as células com 350 microlitros de PBS 2% FBS. Colher as células com 350 microlitros de 0,05% de EDTA por dois minutos a 37 graus Celsius e adicionar dois mililitros de meio de crescimento.
Recolher as células num novo tubo cónico de 50 mililitros e centrifugar a 400 G durante cinco minutos. Passar as APCs para placas de 12 poços, previamente revestidas com matriz de membrana basal de 2,5%, e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque o meio a cada 48 horas até que as células atinjam 80% de confluência.
A 80% de confluência, aspirar qualquer meio de crescimento e substituí-lo por 500 microlitros de meio de diferenciação, contendo 3,3 nanomolares de proteína morfogenética óssea em cada poço. Após 48 horas, substituir o meio por 500 microlitros por meio de diferenciação de poço, e o coquetel de diferenciação. Retirar o meio 72 horas depois e adicionar 100 nanomolares de insulina em 500 microlitros de meio de diferenciação fresco.
48 horas depois, induzir resistência à insulina com quatro nanogramas por mililitro de fator de necrose tumoral alfa, ou TNF alfa. Aspirar qualquer meio de diferenciação e substituí-lo por 500 microlitros de meio simples 2% FBS com TNF alfa. Após incubar por 24 horas, adicionar quatro nanogramas por mililitro de TNF alfa em um meio simples 0% FBS.
Ativar a via de sinalização da insulina 24 horas depois, adicionando insulina nanomolar 100 e incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5%, como mostrado anteriormente. Após a incubação, retire o meio e lave com 500 microlitros de PBS, inclua um poço controle sem o tratamento com insulina. Extrair proteína e medir a fosforilação de marcadores de sinalização de insulina por Western blot.
Células precursoras de adipócitos subcutâneos a 80% de confluência antes de induzir diferenciação nas placas de cultura de 12 poços e adipócitos primários após sete dias de indução da diferenciação são mostrados nesta figura. A resistência insulínica induzida pelo TNF alfa nos adipócitos primários subcutâneos foi demonstrada pela diminuição da fosforilação induzida pela insulina do receptor de insulina, do substrato um do receptor de insulina e da proteína quinase B ou AKT. A membrana foi sondada com anti-receptor de insulina fosforilada, substrato anti-receptor de insulina fosforilada, AKT antifosforilada e anti-beta tubulina foi usada como controle de carga.
O sinal foi visualizado com detecção por quimioluminescência. As manchas representativas e a quantificação a partir de três experimentos independentes são mostradas aqui. Ao tentar esse procedimento, uma coisa que precisa ser cuidada é que a indução de resistência à insulina com TNF alfa é com SFB a 2% por 24 horas e com SFB a 0% nas últimas 24 horas.
