インスリン抵抗性は初代脂肪細胞で評価することができ、痩せた肥満と肥満、または異なる脂肪デポからの細胞など、さまざまな生理病理学的状況下でのドナーの研究を可能にします。初代脂肪細胞は、その固有の特性の多くを保持しており、細胞の環境要因を厳密に制御しながら、定義された条件下で長期間培養することができます。分化プロセスを開始するには、細胞が80%コンフルエントである必要があります。
分化がより低いまたはより高いコンフルエントで始まる場合、細胞はより少なく分化するか、またはそれらの分化能力を失うであろう。動物を犠牲にした後、70%エタノールでこすることによってマウスを消毒する。各マウスから鼠径皮下脂肪組織を解剖し、氷上に15ミリリットルのタイプ1コラゲナーゼ溶液を含む15ミリリットルの円錐管に集める。
脂肪組織を滅菌手術用ハサミで細かく切断し、150 RPMのオービタルシェーカーで摂氏37度でタイプ1コラゲナーゼ溶液と30分間インキュベートしてサンプルを消化します。10分ごとに消化をチェックして、それが機能することを確認し、過剰消化を防ぎます。200マイクロメートルのメッシュシリンジを使用して、コラゲナーゼで消化されていない組織を除去し、フィルターをチューブの端に通して、できるだけ多くの細胞を溶液に排出します。
15ミリリットルの冷たいDMEM 1%BSAを加えて消化を停止し、摂氏4度で10分間400 gで遠心分離します。成熟脂肪細胞を含む最上層とほとんどの液層を吸引します。それに20ミリリットルの冷たいPBS 2%FBSを加え、ペレットを再懸濁します。
再度5分間遠心分離した後、上層を吸引して上清を除去し、残存する脂肪細胞や脂肪を除去した。ペレットを1ミリリットルのACK溶解バッファーに再懸濁します。氷上で5分間インキュベートします。
10ミリリットルのPBS 2%FBSを加えて混ぜます。5分間遠心分離して上清を吸引した後、ペレットを200マイクロリットルの抗FC溶液に再懸濁する。氷上で5分間インキュベートし、細胞懸濁液を磁気セルセパレーターのプレチルドラックに収まる5ミリリットルのチューブに移します。
5分間遠心分離して上清を除去した後、CD31モノクローナル抗体ビオチンとCD45モノクローナル抗体ビオチンの混合物200マイクロリットルを加えます。よく混ぜて氷上で15分間インキュベートします。次に、400マイクロリットルのPBS 2%FBSを加え、摂氏4度で5分間400 Gで再び遠心分離します。
上清を吸引し、100マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズ中で氷上で15分間インキュベートします。400マイクロリットルのPBS 2%FBSを加え、前述のように、摂氏4度で5分間400Gで再び遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットを350マイクロリットルのPBS 2%FBSに再懸濁する。
70マイクロメートルの予備分離フィルターを使用して単一細胞懸濁液から細胞凝集体または大きな粒子を除去するには、100マイクロリットルのPBS 2%FBSでフィルターを活性化します。細胞懸濁液をフィルターに通し、清潔なチューブに集めます。次に、100マイクロリットルのPBS 2%FBSでフィルターを洗浄します。
ネガティブ分離戦略を使用して細胞の磁気分離を実行するには、サンプルをチルドラックの位置Aに置き、2つの空のチューブを位置BとCに配置して、非標識および標識細胞を回収します。次に、洗浄バッファーとランニングバッファーを対応するボトルに入れます。分離セクションで、分離するサンプル数を選択し、枯渇プロトコルを選択します。
実行を押して、分離を開始します。プログラムの最後に、ラベル付けされていないセルを回復します。次に、12ウェルプレートに2.5%基底膜マトリックスを400マイクロリットル添加して基底膜マトリックスをコーティングし、各ウェルの表面全体を覆う。
余分な溶液を取り除き、プレートを層流フード内で少なくとも1時間乾燥させます。5分間遠心分離して上清を捨てた後、ペレットを500マイクロリットルの増殖培地に再懸濁する。脂肪細胞前駆細胞(APC)を、2.5%基底膜マトリックスでコーティングした12ウェルプレートの1ウェルに播種します。
5%二酸化炭素雰囲気中で摂氏37度でインキュベートし、細胞が80%コンフルエントに達するまで48時間ごとに培地を交換します。培地を完全に除去した後、350マイクロリットルのPBS 2%FBSで細胞を洗浄する。350マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで摂氏37度で2分間細胞を回収し、2ミリリットルの増殖培地を加えます。
細胞を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに集め、400 Gで5分間遠心分離します。APCを、予め2.5%基底膜マトリックスでコーティングした12ウェルプレートに継代し、5%二酸化炭素を用いて摂氏37度でインキュベートします。細胞が80%コンフルエントに達するまで、48時間ごとに培地を交換してください。
80%コンフルエントで、任意の増殖培地を吸引し、各ウェルに3.3ナノモルの骨形成タンパク質を含む500マイクロリットルの分化培地と交換します。48時間後、培地を1ウェルあたり500マイクロリットルの分化培地と交換し、分化カクテルとする。72時間後に培地を取り出し、500マイクロリットルの新しい分化培地に100ナノモルのインスリンを加えます。
48時間後、腫瘍壊死因子アルファ、またはTNFアルファのミリリットルあたり4ナノグラムでインスリン抵抗性を誘導します。分化培地を吸引し、TNFアルファを含む500マイクロリットルの単純培地2%FBSと交換します。24時間インキュベートした後、単純な培地0%FBSにTNFアルファ1ミリリットルあたり4ナノグラムを加えます。
24時間後に100ナノモルのインスリンを加えてインスリンシグナル伝達経路を活性化し、前に示したように、5%二酸化炭素雰囲気で摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、500マイクロリットルのPBSで洗浄し、インスリン処理を行わずにコントロールウェルを含む。タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットでインスリンシグナル伝達マーカーのリン酸化を測定します。
12ウェル培養プレートにおける分化誘導前の80%コンフルエントでの皮下脂肪細胞前駆細胞、および分化誘導の7日後の初代脂肪細胞をこの図に示す。皮下初代脂肪細胞におけるTNFアルファによって誘導されるインスリン抵抗性は、インスリン受容体、インスリン受容体基質1、およびプロテインキナーゼBまたはAKTのインスリン誘導性リン酸化の減少によって実証された。メンブレンを抗リン酸化インスリン受容体、抗リン酸化インスリン受容体基質1、抗リン酸化AKT、および抗ベータチューブリンでプローブし、負荷コントロールとして使用した。
シグナルは化学発光検出で可視化した。代表的なブロットと3つの独立した実験からの定量をここに示します。この手順を試みるとき、注意する必要があることの1つは、TNFアルファによるインスリン抵抗性の誘導が24時間2%FBSであり、過去24時間0%FBSであるということです。
