Резистентность к инсулину может быть оценена в первичных адипоцитах, что позволяет изучать доноров в различных физиопатологических контекстах, таких как худой и тучный, или клетки из разных жировых отложений. Первичные адипоциты сохраняют многие из своих внутренних свойств и могут культивироваться в определенных условиях в течение длительного периода времени с жестким контролем клеточных факторов окружающей среды. Чтобы начать процесс дифференцировки, клетки должны быть на 80% слиянии.
Если дифференцировка начинается при более низком или более высоком слиянии, клетки будут дифференцироваться меньше или потеряют свою способность к дифференцировке. После принесения в жертву животного продезинфицируйте мышей, протерев их 70%-ным этанолом. Препарируйте паховую подкожную жировую клетчатку каждой мыши и соберите ее в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую 15 миллилитров раствора коллагеназы первого типа на льду.
Разрежьте жировую ткань на мелкие кусочки стерильными хирургическими ножницами и переварите образцы путем инкубации с раствором коллагеназы первого типа при 37 градусах Цельсия в орбитальном шейкере при 150 об/мин в течение 30 минут. Проверяйте пищеварение каждые 10 минут, чтобы убедиться, что оно работает, и предотвратить чрезмерное пищеварение. Отфильтруйте с помощью шприца с сеткой 200 микрометров, чтобы удалить ткань, не переваренную коллагеназой, и пропустите фильтр через край трубки, чтобы слить как можно больше клеток в раствор.
Добавьте 15 миллилитров холодного DMEM 1% BSA, чтобы остановить пищеварение, и центрифугу при 400 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируют верхний слой, содержащий зрелые адипоциты и большую часть жидкого слоя. Добавьте к нему 20 миллилитров холодного PBS 2% FBS и ресуспендируйте гранулы.
После повторного центрифугирования в течение пяти минут удалите надосадочную жидкость путем аспирации верхнего слоя, чтобы удалить оставшиеся адипоциты и жир. Ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре лизирующего буфера ACK. Инкубировать на льду в течение пяти минут.
Добавьте 10 миллилитров PBS 2% FBS и перемешайте. После центрифугирования в течение пяти минут и аспирации надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах раствора анти-FC. Инкубируйте на льду в течение пяти минут и перенесите суспензию ячейки в пятимиллилитровую пробирку, которая помещается в предварительно охлажденные стойки магнитного сепаратора ячеек.
После центрифугирования в течение пяти минут и устранения надосадочной жидкости добавьте к ней 200 микролитров смеси биотина моноклонального антитела CD 31 и биотина моноклонального антитела CD 45. Хорошо перемешать и выдержать на льду 15 минут. Затем добавьте 400 микролитров PBS 2% FBS и снова центрифугу при 400 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Аспирируйте надосадочную жидкость и инкубируйте ее в 100 микролитрах микрогранул антибиотина в течение 15 минут на льду. Добавьте 400 микролитров PBS 2% FBS и снова центрифугу при 400 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, как показано ранее. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 350 микролитрах PBS 2% FBS.
Чтобы удалить клеточные агрегаты или крупные частицы из одиночных клеточных суспензий с помощью 70-микрометрового фильтра предварительного разделения, активируйте фильтр 100 микролитрами PBS 2% FBS. Пропустите клеточную суспензию через фильтр и соберите ее в чистую пробирку. Затем промойте фильтр 100 микролитрами PBS 2% FBS.
Чтобы выполнить магнитную сепарацию ячеек с использованием стратегии отрицательной сепарации, поместите образец в положение A охлажденной стойки и две пустые пробирки в положения B и C для извлечения немеченых и меченых клеток. Затем загрузите буфер для стирки и буфер для промывки в соответствующие бутылки. В разделе разделения выберите количество образцов, подлежащих разделению, и выберите обедненный протокол.
Нажмите «Выполнить» и начните разделение. В конце программы восстановите немеченые клетки. Затем покройте 12-луночную пластину матрицей базальной мембраны, добавив 400 микролитров 2,5%-ной матрицы фундаментальной мембраны, чтобы покрыть всю поверхность каждой лунки.
Удалите излишки раствора и дайте пластине высохнуть внутри вытяжного шкафа с ламинарным потоком не менее одного часа. После центрифугирования в течение пяти минут и отбрасывания надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 500 микролитрах питательной среды. Засейте клетки-предшественники адипоцитов, или APC, в одну лунку 12-луночной пластины, предварительно покрытой 2,5%-ной матрицей базальной мембраны.
Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% и меняйте среду каждые 48 часов, пока клетки не достигнут 80% слияния. После полного удаления среды промойте ячейки 350 микролитрами PBS 2% FBS. Соберите клетки с 350 микролитрами 0,05% трипсина ЭДТА в течение двух минут при 37 градусах Цельсия и добавьте два миллилитра питательной среды.
Соберите клетки в новую 50-миллилитровую коническую пробирку и центрифугу при 400 G в течение пяти минут. Проведите APC на 12-луночные пластины, предварительно покрытые 2,5%-ной матрицей базальной мембраны, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом. Меняйте среду каждые 48 часов, пока ячейки не достигнут 80% слияния.
При 80%-ном слиянии аспирируйте любую питательную среду и замените ее 500 микролитрами дифференцировочной среды, содержащей 3,3 наномолярных костных морфогенетических белка в каждой лунке. Через 48 часов замените среду на 500 микролитров на лунку для дифференциации и коктейль дифференциации. Удалите среду через 72 часа и добавьте 100 наномоляров инсулина в 500 микролитров свежей среды для дифференцировки.
Через 48 часов индуцируйте резистентность к инсулину с помощью четырех нанограммов на миллилитр фактора некроза опухоли альфа или TNF альфа. Аспирируйте любую дифференцирующую среду и замените ее 500 микролитрами простой среды 2% FBS с TNF альфа. После инкубации в течение 24 часов добавьте четыре нанограмма на миллилитр TNF альфа в простой среде 0% FBS.
Активируйте сигнальный путь инсулина через 24 часа, добавив 100 наномоляров инсулина, и инкубируйте в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% углекислого газа, как показано ранее. После инкубации удаляют среду и промывают 500 микролитрами PBS, включают контрольную лунку без обработки инсулином. Извлеките белок и измерьте фосфорилирование сигнальных маркеров инсулина вестерн-блоттингом.
На этом рисунке показаны клетки-предшественники подкожных адипоцитов при 80%-ном слиянии до индуцирования дифференцировки в 12-луночных культуральных планшетах и первичные адипоциты после семи дней индуцирования дифференцировки. Инсулинорезистентность, индуцированная ФНО-альфа в подкожных первичных адипоцитах, была продемонстрирована снижением инсулин-индуцированного фосфорилирования инсулинового рецептора, инсулинового рецептора и протеинкиназы B или AKT. Мембрану зондировали антифосфорилированным инсулиновым рецептором, антифосфорилированным инсулиновым рецептором использовали субстрат один, антифосфорилированный AKT и анти-бета-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки.
Сигнал визуализировался с помощью хемилюминесцентного детектирования. Здесь показаны репрезентативные блоты и количественная оценка из трех независимых экспериментов. При попытке этой процедуры необходимо позаботиться о том, чтобы индукция резистентности к инсулину с помощью TNF альфа была с 2% FBS в течение 24 часов и с 0% FBS в течение последних 24 часов.
