הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים

המודל שלנו רלוונטי מאוד למחלות דה-מיאלינציה, במיוחד טרשת נפוצה. וזה יכול לתרום לקידום המחקר הרלוונטי מבחינה קלינית. זהו פרוטוקול מפורט שעלול לגרום באופן ישיר לדה-מיאלינציה חמורה במהירות וביציבות בעכברים על ידי הליך כירורגי.

כשאתם מנסים את הטכניקה הזו בפעם הראשונה, היו סבלניים וודאו שהקואורדינטות מדויקות. התחל על ידי חיבור מחט 32 מד מזרק 5 microliter. למשוך 5 microliters של פתרון LPC להכנת ההזרקה.

לאחר מכן, לאשר את עומק ההרדמה של העכבר על ידי חוסר רפלקס צביטה הבוהן בעוד הנשימה חלקה. מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית כשהצד הגבי כלפי מעלה, והדק את הראש באמצעות חרוט אף ומהדק שיניים. תקן את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי עם פסי אוזניים דו-צדדיים.

ודאו שפסי האוזניים ישרים והראש אופקי ויציב. לחטא את עור הראש על ידי ניגוב עם יודופור. לאחר מכן השתמש באזמל כדי לחתוך חתך קטן לכ -1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.

נגבו את המיומנות עם צמר גפן טבול ב-1% מי חמצן עד שהברגמה, הלמבדה והפונטנל האחורי ייחשפו. מניחים את המזרק על המנגנון הסטריאוטקסי. ודא את המיקום האופקי של ראש החיה, ולאתר את קורפוס callosum.

לאחר קביעת אתר ההזרקה, להקליט את הקואורדינטות, ולעשות סימן עם סמן על הגולגולת. קדח בעדינות את האתר המסומן עם מקדחת גולגולת. היזהר כדי למנוע כל דימום.

הזיזו באיטיות את המחט לקואורדינטות הנתונות. כדי לגרום לדה-מיאלינציה של קורפוס קלוסום, הזריקו 2 מיקרוליטרים של תמיסת LPC בכל אתר הזרקה בקצב של 0.4 מיקרוליטר לדקה. לאחר ההזרקה, לשמור את המחט בכל אתר במשך 10 דקות נוספות.

לבסוף, לתפור את העור עם תפר 4-0, ולחכות החיה להתעורר בתוך 10 דקות. התמונה המייצגת מראה את זיהוי לגיונות החומר הלבן באמצעות צביעה כחולה מהירה של לוקסול. מן התוצאות, demyelination יציב של קורפוס callosum ניתן לראות ב 10 ו 28 ימים לאחר ההזרקה.

הכימות של אזור הדה-מיאלינציה בנקודות זמן שונות מוצג כאן. באמצעות הכתמה אימונופלואורסצנטית של חלבון בסיסי מיאלין פגום, נצפתה עלייה יוצאת דופן של dMBP בקבוצה המוזרקת LPC ב-10 ימים לאחר ההזרקה, מה שמייצג אובדן מיאלין בקורפוס קלוסום. ניתוח כתמים מערביים של חלבון המיאלין הבסיסי, או MBP, ביטוי הראה אובדן משמעותי של MBP לאחר הזרקת LPC.

בטא-אקטין שימש כבקרת הטעינה למדידת הביטוי הבסיסי. תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשרות את המבנה האולטרה-מיאלי בקורפוס קלוסום של קבוצת שאם וקבוצה מוזרקת LPC. GST-pi הוא הסמן של תא מבשר אוליגודנדרוציטים, או OPC, הבשלת התמיינות .

לאחר 10 ימים של הזרקת LPC, ה-GST-pi ירד בהשוואה לקבוצת ה-sham. יחד עם זאת, יכולת ההתרבות של אוליגודנדרוציטים יכולה לבוא לידי ביטוי על ידי היחס בין התפשטות האוליגודנדרוציטים לבין סך תאי השושלת של אוליגודנדרוציטים. היחס הגבוה יותר מייצג התפשטות רבה יותר של אוליגודנדרוציטים לאחר 10 ימים לאחר ההזרקה.

התמונות המייצגות מציגות את מסלול השחייה של העכברים בכל קבוצה, בנוכחות הפלטפורמה ולאחר הסרת הפלטפורמה. התוצאות מצביעות על כך שהזיכרון המרחבי של עכברים שעברו דה-מיאלינט נפגע באופן משמעותי במודל הזרקת LPC בעל שתי הנקודות. בעת ניסיון הליך זה, ודא כי קצב ההזרקה הוא מדויק, ולשמור את המחט בכל אתר במשך 10 דקות נוספות.