Il nostro modello è molto rilevante per le malattie demielinizzanti, in particolare la sclerosi multipla. E può contribuire al relativo avanzamento della ricerca clinicamente rilevante. È un protocollo dettagliato che potrebbe causare direttamente una grave demielinizzazione in modo rapido e stabile nei topi mediante procedura chirurgica.
Quando provi questa tecnica per la prima volta, sii paziente e assicurati che le coordinate siano accurate. Iniziare collegando un ago da 32 gauge a una siringa da 5 microlitri. Prelevare 5 microlitri di soluzione LPC per la preparazione dell'iniezione.
Quindi, confermare la profondità dell'anestesia del mouse dalla mancanza di riflesso del pizzico della punta mentre la respirazione è regolare. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica con il lato dorsale verso l'alto e fissare la testa con un cono del naso e un morsetto per denti. Fissare il mouse all'apparato stereotassico con barre auricolari bilaterali.
Assicurarsi che le barre auricolari siano livellate e che la testa sia orizzontale e stabile. Disinfettare la pelle della testa strofinando con iodoporo. Quindi utilizzare il bisturi per tagliare una piccola incisione a circa 1,5 centimetri lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.
Pulire l'abilità con un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno all'1% fino a quando il bregma, la lambda e la fontanella posteriore sono esposti. Posizionare la siringa sull'apparecchio stereotassico. Assicurarsi il posizionamento orizzontale della testa dell'animale e individuare il corpo calloso.
Una volta determinato il sito di iniezione, registrare le coordinate e fare un segno con un marcatore sul cranio. Forare delicatamente il sito contrassegnato con un trapano a teschio. Fare attenzione ad evitare qualsiasi sanguinamento.
Spostare lentamente l'ago sulle coordinate indicate. Per indurre la demielinizzazione del corpo calloso, iniettare 2 microlitri di soluzione LPC in ciascun sito di iniezione ad una velocità di 0,4 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, tenere l'ago in ogni sito per altri 10 minuti.
Infine, sutura la pelle con una sutura 4-0 e attendi che l'animale si svegli entro 10 minuti. L'immagine rappresentativa mostra il rilevamento delle legioni di materia bianca tramite la colorazione blu veloce Luxol. Dai risultati, la demielinizzazione stabile del corpo calloso può essere osservata a 10 e 28 giorni dopo l'iniezione.
La quantificazione dell'area di demielinizzazione in diversi punti temporali è mostrata qui. Attraverso la colorazione immunofluorescenziale della proteina basica della mielina degradata, è stato osservato un notevole aumento di dMBP nel gruppo iniettato con LPC a 10 giorni dopo l'iniezione, che rappresenta la perdita di mielina nel corpo calloso. L'analisi Western blot dell'espressione della proteina basica della mielina, o MBP, ha mostrato una significativa perdita di MBP dopo l'iniezione di LPC.
La beta-actina è stata utilizzata come controllo di carico per misurare l'espressione basale. Le immagini al microscopio elettronico confermano l'ultrastruttura mielinica nel corpo calloso del gruppo sham e del gruppo iniettato da LPC. GST-pi è il marker della maturazione della differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti, o OPC.
Dopo 10 giorni di iniezione di LPC, il GST-pi è diminuito rispetto al gruppo sham. Allo stesso tempo, la capacità di proliferazione degli oligodendrociti può essere riflessa dal rapporto tra oligodendrociti proliferano e cellule totali della linea oligodendrocitaria. Il rapporto più elevato rappresenta una maggiore proliferazione degli oligodendrociti dopo 10 giorni dall'iniezione.
Le immagini rappresentative mostrano il percorso di nuoto dei topi in ogni gruppo, in presenza della piattaforma e dopo aver rimosso la piattaforma. I risultati suggeriscono che la memoria spaziale dei topi demielinizzati è significativamente compromessa nel modello di iniezione LPC a due punti. Durante il tentativo di questa procedura, assicurarsi che la velocità di iniezione sia accurata e tenere l'ago in ciascun sito per altri 10 minuti.
