Nuestro modelo es muy relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la esclerosis múltiple. Y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Es un protocolo detallado que podría causar directamente una desmielinización severa de forma rápida y estable en ratones mediante un procedimiento quirúrgico.
Al probar esta técnica por primera vez, sea paciente y asegúrese de que las coordenadas sean precisas. Comience conectando una aguja de calibre 32 a una jeringa de 5 microlitros. Extraiga 5 microlitros de solución LPC para la preparación de la inyección.
A continuación, confirme la profundidad de la anestesia del ratón por la falta de reflejo de pellizco del dedo del pie mientras la respiración es suave. Coloque el ratón en el marco estereotáxico con el lado dorsal hacia arriba y asegure la cabeza con un cono nasal y una pinza dental. Fije el ratón al aparato estereotáxico con barras auriculares bilaterales.
Asegúrese de que las barras para los oídos estén niveladas y que la cabeza esté horizontal y estable. Desinfecte la piel de la cabeza limpiando con yodóforo. Luego use bisturí para cortar una pequeña incisión a aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.
Limpie la habilidad con un hisopo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno al 1% hasta que el bregma, lambda y la fontanela posterior estén expuestos. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxico. Asegurar la posición horizontal de la cabeza del animal, y localizar el cuerpo calloso.
Una vez que se determine el sitio de inyección, registre las coordenadas y haga una marca con un marcador en el cráneo. Perfore suavemente el sitio marcado con un taladro de cráneo. Tenga cuidado de evitar cualquier sangrado.
Mueva lentamente la aguja a las coordenadas dadas. Para inducir la desmielinización del cuerpo calloso, inyecte 2 microlitros de solución LPC en cada sitio de inyección a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto. Después de la inyección, mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.
Finalmente, suture la piel con una sutura 4-0 y espere a que el animal se despierte en 10 minutos. La imagen representativa muestra la detección de las legiones de materia blanca a través de la tinción azul rápida de Luxol. A partir de los resultados, se puede observar una desmielinización estable del cuerpo calloso a los 10 y 28 días después de la inyección.
La cuantificación del área de desmielinización en diferentes puntos de tiempo se muestra aquí. A través de la tinción de inmunofluorescencia degradó la proteína básica de mielina, se observó un aumento notable de dMBP en el grupo inyectado LPC a los 10 días después de la inyección, lo que representa la pérdida de mielina en el cuerpo calloso. El análisis de Western blot de la expresión de la proteína básica de mielina, o MBP, mostró una pérdida significativa de MBP después de la inyección de LPC.
La beta-actina se utilizó como control de carga para medir la expresión basal. Las imágenes de microscopía electrónica confirman la ultraestructura mielinizada en el cuerpo calloso del grupo simulado y el grupo inyectado LPC. GST-pi es el marcador de la maduración de la diferenciación de la célula precursora de oligodendrocitos, u OPC.
Después de 10 días de inyección de LPC, el GST-pi disminuyó en comparación con el grupo simulado. Al mismo tiempo, la capacidad de proliferación de los oligodendrocitos puede reflejarse en la proporción de oligodendrocitos proliferan y las células de linaje de oligodendrocitos totales. La proporción más alta representa una mayor proliferación de oligodendrocitos después de 10 días después de la inyección.
Las imágenes representativas muestran la trayectoria de natación de los ratones en cada grupo, en presencia de la plataforma y después de retirar la plataforma. Los resultados sugieren que la memoria espacial de los ratones desmielinizados se ve significativamente afectada en el modelo de inyección LPC de dos puntos. Mientras intenta este procedimiento, asegúrese de que la velocidad de inyección sea precisa y mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.
