שיטה זו מוקדשת לחקר תפקידם של מיקרוטובולים במהלך פלישה לסרטן המוח על ידי צימוד הזרקה אטופית של תאי סרטן המוח בדגי זברה להדמיה התוך-תאית התת-תאית. היתרון העיקרי של הטכניקה טמון ברזולוציה הטמפורלית המרחבית הגבוהה שבה נרכש השלד המיקרוטובולי cytoskele. הוא ייחודי למודלים של פלישה לסרטן המוח in vivo והוא מאפשר ניתוח מעמיק של דינמיקה של מיקרוטובולים.
ההדמיה התת-תאית של פלישת תאי סרטן המוח באתרה יכולה לשמש לניתוח של כל חלבון בעל עניין שעשוי להיות מעורב בפלישה לסרטן. כדי להתחיל, לשטוף את תאי גליובלסטומה בתרבית ב 37 מעלות צלזיוס עם PBS. נתק את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA ודגרה במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור התאים עד שכל התאים מנותקים לחלוטין.
השהה את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום תאי גליובלסטומה שלם בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. מוסיפים 45 מיליליטר של PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-134 פעמים G למשך חמש דקות. השליכו את ה-supernatant והחזירו את התאים עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח על ידי צנרת מעלה ומטה ביסודיות.
מוסיפים עוד 49 מיליליטר של PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-134 פעמים G למשך חמש דקות. השליכו את הסופר-נטנט והחזירו את התאים ל-200 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח. יש לאחסן על קרח למשך הליך ההשתלה.
כדי להזריק במיקרו את תאי הגליובלסטומה לזחלי דגי הזברה באמצע המוח, מלאו צלחת יצוקה עם שישה מיליליטרים של מדיום E3 בתוספת 160 מיליגרם לליטר טריקאין. העבירו תריסר זחלי DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED לתוך צלחת המיקרו-הזרקה. ברגע שהזחלים מורדמים ולא מגיבים לחלוטין למגע יישרו אותם בתעלות שעל צדם, ראש למעלה ושק החלמון נדחף אל קיר התעלה עם מכחול בגודל 00.
לאחר מכן טען חמישה מיקרוליטרים של תאי גליובלסטומה לתוך נימי המיקרו באמצעות קצוות מיקרו-טעינה והכנס את הנימים למחזיק הנימים האוניברסלי. הניחו את לוחית המיקרו-הזרקה המכילה את הזחלים המורדמים על במת המיקרוסקופ הסטריאופוני. מניחים את קצה המיקרו-נימי על גבול צלחת המיקרו-הזרקה באמצעות ידיות המיקרו-מניפולטור.
לאחר מכן לשבור אותו עם אזמל כדי ליצור נקודת כניסה חדה בערך בגודל של קוטר התא. ודא שהתאים זורמים מתוך הנימים על ידי הזרמת שמן בעדינות במיקרו-מזרק וצניחה של קצה המחט לתוך המדיום. רכז את התאים בקצה הנימי כדי למקסם את מספר התאים המוזרקים לכל נפח מוזרק והימנע ממילוי רקמת המוח ב- PBS.
בחן היטב את התאים היוצאים מהמיקרו נימי כאשר שמן מוכנס ידנית לתוך המזרק. הגדר באופן אמפירי את מספר הסיבובים הדרוש על הידית הידנית כדי לספק 20 עד 50 תאים. בדרך כלל, אם התאים מרוכזים מספיק, מספיק סיבוב עדין אחד כדי לפלוט כ-10 תאים.
יש לגשת לקצה הנימי כנגד הרקטום האופטי השמאלי ממש מעל הווריד המוחי האמצעי. יש ללחוץ בעדינות על הנימים כנגד הזחלים עד שקרום העור נשבר. ברגע שמגיעים למיקום מתאים בטקטום האופטי, מוציאים את התאים.
בזהירות להתבונן בקצה של נימי כדי לדמיין את זרם התאים הולך בתוך החיה ובכך להבטיח הזרקה מוצלחת. חזור על ההליך עבור בעלי חיים רבים ככל הנדרש. בהתאם למהירות ההזרקה של הנסיין, ייתכן שיהיה צורך בהחלפת מחט כל 10 עד 20 זחלים עקב התגבשות מהירה של תאים בנימי.
לאחר השלמת השתלת הקסנו, הסר את הזחל מצלחת המיקרו-הזרקות ובודד אותם בצלחת באר 24 מלאה במים ממקור מינרלי PTU ומדיום כחול מתילן. הכינו תמיסת AH-KROH עם התכה נמוכה ב-1%. העבירו 500 מיקרוליטרים של תמיסת AH-KROH מותכת 1% נמוכה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ותנו לו להתקרר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על בלוק חום.
מוסיפים 160 מיקרוגרם לליטר טריקיין ל-AH-KROHS ומערבבים היטב. העבירו זחל אחד עד ארבעה זחלי קסנוגרפט לצלחת פטרי באורך 3.5 ס"מ מלאה במים ממקור מינרלי PTU ומדיום מתילן בתוספת 160 מיקרוגרם לליטר טריקאין. לאחר שהזחל מורדם ואינו מגיב לחלוטין למגע, העבירו אותם בזהירות לתוך הצינור המכיל את ה- AH-KROHS והטריקיין באמצעות פיפטה עדינה להעברת חוד עדין.
מערבבים בעדינות את הזחל עם AH-KROHS. באמצעות פיפטה גדולה להעברת נורה, הנח את הזחלים המעורבים ב- AH-KROHS על מרכז צלחת הדמיית וידאו עם תחתית זכוכית באורך 3.5 ס"מ תחת מיקרוסקופ סטריאו מקם במהירות את הזחלים על גבם. באמצעות קצה העמסה זעיר הסר AH-KROHS נוספים כדי לשמור על שכבת AH-KROHS הדקה ביותר האפשרית.
לאחר AH-KROHS התמצק, להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיום הדמיה. עבור הדמיה חיה in vivo, של דינמיקה microtubule בתאי גליובלסטומה פולשים, למקם את צלחת הדמיית וידאו המכילה את AH-KROHS מוטבע xenografted זחלים בתא הסביבתי של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם טמפרטורה שנקבעה על 32 מעלות צלזיוס. מצא את הזחלים בצלחת הדמיית הווידאו עם מטרה של פי 10 באמצעות שלב XY ממונע.
לחץ על Escape כדי להנמיך את צריח המטרות ולהוסיף שמן מינרלי על מטרת שמן 60x, ולחץ על Escape כדי לחזור למצב המוקד הראשוני. שימו לב לתאי הגליובלסטומה הפולשים בתעלה האדומה המוגדרת במקור לייזר של 561 ננומטר, 20% עוצמת לייזר וחשיפה בזמן של 200 אלפיות השנייה. לאחר מכן בחר תא עם רשת מיקרוטובולים פרושה וחוטי מיקרוטובול הניתנים להבחנה בקלות.
קבע את ההגדרות של סדרת Z. באמצעות שלב piezo בטווח של 200 מיקרומטר, בחר את המיקומים העליונים והתחתונים של רשת המיקרוטובול, כאשר ערימת Z בעומק 10 עד 30 מיקרומטר מספיקה כדי לדמיין את הרשת המיקרוביאלית בבליטה של התא הנודד עם שלב פרוסת Z של 0.3 מיקרומטר. הגדר הגדרות רכישה של קיטועי זמן כדי לאפשר איזון אופטימלי בין מהירות הרכישה, עומק מחסנית Z ואות פלואורסצנטי כדי למנוע הלבנת תמונות מהירה.
קבל תמונות של המיקרוטובולים כל חמש עד 10 שניות למשך מספר דקות ושמור את ערימת ההיפר-ממד 5D. הדינמיקה של המיקרוטובולים נמדדה על ידי בניית קימוגרף לאורך מיקרוטובולים גדלים ומתכווצים ומעקב ידני אחר קצוות מיקרוטובולים בודדים לאורך זמן. טיפול תרופתי הניתן במדיום הזחל והשפעתו ההפיכה על ארגון רשת המיקרוטובולים הוערך על ידי טיפול במינון של 200 ננומולרים של נוקודאזול.
זה הוביל להתכווצות הדרגתית של רשת המיקרוטובולים ולהיעלמות של בליטה של תאי גליובלסטומה לאחר ארבע שעות. שטיפת התרופה החזירה את יכולתם של תאי גליובלסטומה ליצור בליטות. התאים חזרו לנדוד לאורך כלי הדם 12 שעות לאחר ההדחה, מה שמצביע על כך שמינון של 200 ננומול של נוקודזול הספיק כדי לשבש את רשת המיקרוטובול ולחסום במהירות פלישה של תאי גליובלסטומה in vivo.
ניתוח בן שלושה ימים של אותו טיפול על פלישת תאי גליובלסטומה גלובלית גילה כי הנוקודזול עצר פלישה ארוכת טווח של תאי גליובלסטומה in vivo מבלי להשפיע על הבריאות הכללית של הדגים בהשוואה לבקרה. זכרו להתחיל עם זחלים בריאים שלושה ימים לאחר ההפריה כדי לרכז את התאים לתוך הנימי, למזער את הנפח המוזרק במוח, וליצור מסת גידול ייחודית, ונסו להימנע מהזרקה לחדרי המוח.
