이 방법은 제브라 피쉬의 뇌암 세포의 아토피 주사를 세포 내 생체 내 영상에 결합하여 뇌암 침범 중 미세 소관의 역할을 조사하는 데 전념합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 미세 소관 세포 골격이 획득되는 높은 공간적 시간 분해능에 있습니다. 생체 내 뇌암 침습 모델에 고유하며 심층적인 미세소관 역학 분석이 가능합니다.
현장 뇌암 세포 침윤의 세포 내 영상화는 암 침습에 잠재적으로 관여하는 임의의 관심 단백질의 분석에 사용될 수 있다. 시작하려면 섭씨 37도에서 배양한 교모세포종 세포를 PBS로 세척합니다. 0.05% 트립신 EDTA 1밀리리터를 첨가하고 모든 세포가 완전히 분리될 때까지 세포 배양기에서 섭씨 37도에서 5-10분 동안 배양하여 세포를 분리합니다.
50 밀리리터 원심분리 튜브에 5 밀리리터의 완전한 교 모세포종 세포 배지에 세포를 재현 탁시킵니다. 얼음처럼 차가운 PBS 45ml를 넣고 G를 134배로 5분간 원심분리한다. 상청액을 버리고 완전히 위아래로 피펫팅하여 얼음처럼 차가운 PBS 1밀리리터로 세포를 재현탁시킵니다.
얼음처럼 차가운 PBS 49 밀리리터를 더 넣고 134 배 G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 200 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁시킨다. 이식 절차 기간 동안 얼음 위에 보관하십시오.
교모세포종 세포를 제브라피쉬 유충 중뇌에 미세 주입하려면 트리카인 1리터당 160mg이 보충된 E3 배지 6밀리리터로 미세 주입 캐스트 플레이트를 채웁니다. 12 개의 DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED 유충을 미세 주입 판으로 옮깁니다. 유충이 마취되고 접촉에 완전히 반응하지 않으면 측면의 참호에 정렬하고 머리를 위로 향하게하고 난황낭을 크기 00 페인트 브러시로 참호 벽에 밀어 넣습니다.
그런 다음 마이크로로딩 팁을 사용하여 5마이크로리터의 교모세포종 세포를 마이크로 모세관에 로드하고 모세관을 범용 모세관 홀더에 삽입합니다. 마취된 유충을 함유하는 미세주입 플레이트를 실체 현미경 스테이지 상에 놓는다. 마이크로 매니퓰레이터 손잡이를 사용하여 마이크로 캐필러리의 끝을 미세 주입 플레이트의 경계에 놓습니다.
그런 다음 메스로 부수어 대략 세포 직경 크기의 날카로운 진입 점을 만듭니다. 마이크로 인젝터에서 오일을 부드럽게 흐르게 하고 바늘 끝을 배지에 밀어 넣어 세포가 모세관 밖으로 흘러나오는지 확인합니다. 모세관 끝에 세포를 집중시켜 주입된 부피당 주입된 세포 수를 최대화하고 뇌 조직에 PBS가 채워지지 않도록 합니다.
오일이 주입기에 수동으로 주입될 때 미세 모세관에서 나오는 세포를 주의 깊게 검사하십시오. 20-50개의 셀을 전달하기 위해 수동 노브에 필요한 회전 수를 경험적으로 정의합니다. 일반적으로 세포가 충분히 농축되면 한 번의 부드러운 회전으로 약 10 개의 세포를 배출 할 수 있습니다.
모세 혈관의 끝 부분을 중간 대뇌 정맥 바로 위의 왼쪽 시신경에 접근하십시오. 피부 막이 부서 질 때까지 모세관을 유충에 부드럽게 누르십시오. 시신경의 적절한 위치에 도달하면 세포를 꺼냅니다.
모세관의 끝을주의 깊게 관찰하여 동물 내부로 들어가는 세포의 흐름을 시각화하여 성공적인 주사를 보장합니다. 필요한만큼의 동물에 대해이 절차를 반복하십시오. 실험자가 주입하는 속도에 따라 모세관의 빠른 세포 응집으로 인해 10-20 마리의 유충마다 바늘을 교체해야 할 수 있습니다.
이종 이식이 완료되면 미세 주입 플레이트에서 유충을 제거하고 미네랄 공급원 물 PTU와 메틸렌 블루 배지로 채워진 24 웰 플레이트에서 유충을 골라냅니다. 1%저융점 AH-KROH 용액을 준비합니다. 500 마이크로 리터의 끓인 1 % 저 융점 AH-KROH 용액을 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 옮기고 열 블록에서 섭씨 37도에서 식히십시오.
AH-KROHS에 트리카인 리터당 160마이크로그램을 첨가하고 잘 섞는다. 1-4 개의 이종 이식 유충을 미네랄 공급원 물 PTU와 메틸렌 배지로 채워진 3.5 센티미터의 페트리 접시에 옮기고 트리카인 리터당 160 마이크로 그램을 보충합니다. 유충이 마취되고 접촉에 완전히 반응하지 않으면 미세한 팁 전달 피펫을 사용하여 AH-KROHS와 트리카인이 들어있는 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
유충을 AH-KROHS와 부드럽게 섞는다. 큰 전구 이송 피펫을 사용하여 AH-KROHS에 혼합 된 유충을 유리 바닥의 3.5cm 비디오 이미징 접시 중앙에 놓고 실체 현미경으로 유충을 뒤쪽에 빠르게 배치합니다. 마이크로 로딩 팁을 사용하여 여분의 AH-KROHS를 제거하여 가능한 가장 얇은 AH-KROHS 층을 유지합니다.
AH-KROHS가 고형화되면 2.5 밀리리터의 이미징 매체를 추가하십시오. 침입하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 생체 내 라이브 이미징을 위해 AH-KROHS 내장 이종 이식 유충이 포함된 비디오 이미징 접시를 섭씨 32도로 설정된 온도의 도립 컨포칼 현미경의 환경 챔버에 놓습니다. 전동 XY 스테이지를 사용하여 10x 대물렌즈로 비디오 이미징 접시에서 유충을 찾습니다.
탈출을 눌러 대물렌즈 포탑을 내리고 60x 오일 대물렌즈에 광유를 추가하고 탈출을 눌러 초기 초점 위치로 돌아갑니다. 561 나노 미터 레이저 소스, 20 % 레이저 출력 및 200 밀리 초의 시간 노출로 설정된 빨간색 채널에서 침입하는 교 모세포종 세포를 관찰하십시오. 그런 다음 미세소관 네트워크가 분산되어 있고 쉽게 구별할 수 있는 미세소관 필라멘트가 있는 세포를 선택합니다.
Z 시리즈 설정을 지정합니다. 200 마이크로 미터 범위의 피에조 스테이지를 사용하여 10-30 마이크로 미터 깊이의 Z 스택으로 0.3 마이크로 미터의 Z 슬라이스 단계로 이동하는 세포의 돌출부에서 미생물 네트워크를 시각화하기에 충분한 미세 소관 네트워크의 상단 및 하단 위치를 선택하십시오. 빠른 광 표백을 방지하기 위해 획득 속도, Z 스택 깊이 및 형광 신호 간의 최적 균형을 허용하도록 타임랩스 획득 설정을 지정합니다.
몇 분 동안 5-10초마다 미세소관의 이미지를 수집하고 5D 하이퍼 스택을 저장합니다. 미세소관 역학은 성장 및 축소하는 미세소관을 따라 키모그래프를 구축하고 시간이 지남에 따라 개별 미세소관 가장자리를 수동으로 추적하여 측정했습니다. 유충 배지에서 투여 된 약물 치료 및 미세 소관 네트워크 조직에 대한 가역적 효과는 200 나노 몰 용량의 노코다졸로 처리함으로써 평가되었습니다.
이로 인해 미세 소관 네트워크가 점진적으로 수축되고 4 시간 후에 교 모세포종 세포 돌출이 사라졌습니다. 약물을 씻어 내면 교 모세포종 세포가 돌출부를 형성 할 수있는 능력이 회복되었습니다. 세포는 세척 후 12시간 후에 혈관구조를 따라 이동을 재개하여 200나노몰 용량의 노코다졸이 미세소관 네트워크를 파괴하고 생체 내 교모세포종 세포 침윤을 신속하게 차단하기에 충분하다는 것을 나타냅니다.
전 세계 교모세포종 세포 침습에 대한 동일한 치료법에 대한 3일 간의 분석에서 노코다졸은 대조군에 비해 물고기의 일반적인 건강에 영향을 미치지 않으면서 생체 내에서 장기 교모세포종 세포 침습을 중단시키는 것으로 나타났습니다. 건강한 3 일 후 수정 유충으로 시작하여 세포를 모세 혈관에 집중시키고, 뇌에 주입되는 양을 최소화하고, 독특한 종양 덩어리를 형성하고, 뇌실에 주사를 피하십시오.
