Este método é dedicado à investigação do papel dos microtúbulos durante a invasão do câncer cerebral, acoplando a injeção atópica de células cancerígenas cerebrais em peixes-zebra à imagem intravital subcelular. A principal vantagem da técnica reside na alta resolução temporal espacial em que o citoesqueleto dos microtúbulos é adquirido. É único para modelos de invasão de câncer cerebral in vivo e permite uma análise dinâmica de microtúbulos em profundidade.
A imagem subcelular da invasão de células cancerígenas cerebrais in situ pode ser usada para a análise de qualquer proteína de interesse potencialmente envolvida na invasão do câncer. Para começar, lave as células de glioblastoma cultivadas a 37 graus Celsius com PBS. Desprenda as células adicionando um mililitro de 0,05% de tripsina EDTA e incubando por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius na incubadora de células até que todas as células estejam totalmente separadas.
Ressuscite as células em cinco mililitros de meio celular de glioblastoma completo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Adicione 45 mililitros de PBS gelado e centrifugar a 134 vezes G por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com um mililitro de PBS gelado, pipetando para cima e para baixo completamente.
Adicione mais 49 mililitros de PBS gelado e centrifugar a 134 vezes G por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de PBS gelado. Armazenar no gelo durante o procedimento de transplante.
Para micro injetar as células de glioblastoma no mesencéfalo das larvas de peixe-zebra, preencha uma placa de microinjeção com seis mililitros de meio E3 suplementado com 160 miligramas por litro de tricaína. Transfira uma dúzia de larvas DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED para a placa de microinjeção. Uma vez que as larvas estejam anestesiadas e totalmente sem resposta ao toque, alinhe-as nas trincheiras de lado, a cabeça para cima e o saco vitelino empurrado contra a parede da trincheira com um pincel de tamanho 00.
Em seguida, carregue cinco microlitros de células de glioblastoma no microcapilar usando pontas de microcarga e insira o capilar no suporte capilar universal. Coloque a placa de microinjeção contendo as larvas anestesiadas no estágio do microscópio estéreo. Coloque a ponta do microcapilar na borda da placa de microinjeção usando os botões do micromanipulador.
Em seguida, quebre-o com um bisturi para criar um ponto de entrada afiado aproximadamente do tamanho do diâmetro de uma célula. Verifique se as células estão fluindo para fora do capilar passando suavemente o óleo no microinjetor e mergulhando a ponta da agulha no meio. Concentre as células na ponta do capilar para maximizar o número de células injetadas por volume injetado e evite encher o tecido cerebral com PBS.
Examine cuidadosamente as células que saem do microcapilar à medida que o óleo é introduzido manualmente no injetor. Defina empiricamente o número de voltas necessárias no botão manual para entregar de 20 a 50 células. Normalmente, se as células estiverem concentradas o suficiente, uma volta suave é suficiente para ejetar aproximadamente 10 células.
Aproxime-se da ponta do capilar contra o tecto óptico esquerdo, logo acima da veia cerebral média. Pressione suavemente o capilar contra as larvas até que a membrana da pele se rompa. Uma vez que uma posição adequada no tecto óptico é alcançada, ejete as células.
Observe cuidadosamente a ponta do capilar para visualizar o fluxo de células que entram no interior do animal, garantindo assim uma injeção bem-sucedida. Repita o procedimento para quantos animais forem necessários. Dependendo da rapidez com que o experimentador está na injeção, uma mudança de agulha pode ser necessária a cada 10 a 20 larvas devido à rápida aglomeração celular no capilar.
Uma vez que o transplante de xeno esteja completo, remova a larva da placa de microinjeção e isole-a em uma placa de 24 poços preenchida com PTU de água de fonte mineral e meio azul de metileno. Prepare uma solução AH-KROH de fusão de 1% de baixa. Transfira 500 microlitros de solução de AH-KROH fervida a 1% de baixa fusão para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e deixe-a esfriar a 37 graus Celsius em um bloco de calor.
adicione 160 microgramas por litro de tricapina ao AH-KROHS e misture bem. Transfira de uma a quatro larvas xenoenxertadas para uma placa de Petri de 3,5 centímetros preenchida com água mineral PTU e meio de metileno complementado com 160 microgramas por litro de tricaína. Uma vez que as larvas estejam anestesiadas e totalmente sem resposta ao toque, transfira-as cuidadosamente para o tubo que contém o AH-KROHS e a tricadina usando uma pipeta de transferência de ponta fina.
Misture suavemente a larva com o AH-KROHS. Usando uma pipeta de transferência de bulbo grande, coloque as larvas misturadas no AH-KROHS no centro de um prato de imagem de vídeo de 3,5 centímetros com fundo de vidro Sob um microscópio estéreo, posicione rapidamente as larvas em suas costas. Usando uma micro ponta de carga, remova AH-KROHS extra para manter a camada AH-KROHS mais fina possível.
Uma vez que o AH-KROHS tenha se solidificado, adicione 2,5 mililitros de meio de imagem. Para a imagem in vivo in vivo, da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invasoras, coloque a placa de imagem de vídeo contendo as larvas xenoenxertadas embutidas AH-KROHS na câmara ambiental de um microscópio confocal invertido com uma temperatura definida em 32 graus Celsius. Encontre as larvas no prato de imagem de vídeo com uma objetiva de 10x usando um estágio XY motorizado.
Pressione o escape para abaixar a torre de objetivos e adicione óleo mineral a um objetivo de óleo de 60x, e pressione o escape para voltar à posição focal inicial. Observe as células invasoras de glioblastoma no canal vermelho ajustado em fonte de laser de 561 nanômetros, 20% de potência do laser e uma exposição de tempo de 200 milissegundos. Em seguida, selecione uma célula com uma rede de microtúbulos espalhada e filamentos de microtúbulos facilmente distinguíveis.
Defina as configurações da série Z. Usando um estágio piezo de alcance de 200 micrômetros, selecione as posições superior e inferior da rede de microtúbulos, onde uma pilha Z de 10 a 30 micrômetros de profundidade é suficiente para visualizar a rede microbiana na protrusão da célula migratória com um passo de fatia Z de 0,3 micrômetros. Defina as configurações de aquisição de lapso de tempo para permitir um equilíbrio ideal entre a velocidade de aquisição, a profundidade da pilha Z e o sinal fluorescente para evitar o rápido branqueamento de fotos.
Adquira imagens dos microtúbulos a cada cinco a 10 segundos por vários minutos e salve a hiperpilha 5D. A dinâmica dos microtúbulos foi medida através da construção de quimógrafos ao longo de microtúbulos em crescimento e encolhimento e rastreando manualmente as bordas individuais dos microtúbulos ao longo do tempo. O tratamento medicamentoso administrado no meio larva e seu efeito reversível na organização da rede de microtúbulos foi avaliado pelo tratamento com uma dose nanomolar de 200 nocodazol.
Isso levou ao encolhimento progressivo da rede de microtúbulos e ao desaparecimento da protrusão celular do glioblastoma após quatro horas. A lavagem da droga restaurou a capacidade das células do glioblastoma de formar saliências. As células voltaram a migrar ao longo da vasculatura 12 horas após o washout, indicando que uma dosagem de 200 nanomoles de nocodazol foi suficiente para interromper a rede de microtúbulos e bloquear rapidamente a invasão celular de glioblastoma in vivo.
Uma análise de três dias do mesmo tratamento na invasão celular global do glioblastoma revelou que o nocodazol interrompeu a invasão celular de glioblastoma a longo prazo in vivo sem afetar a saúde geral dos peixes em comparação com um controle. Lembre-se de começar com larvas saudáveis três dias após a fertilização para concentrar as células no capilar, minimizar o volume injetado no cérebro e formar uma massa tumoral única e tentar evitar a injeção nos ventrículos cerebrais.
