Этот метод посвящен исследованию роли микротрубочек во время инвазии рака мозга путем связи атопической инъекции раковой клетки мозга у рыбок данио с субклеточной прижизненной визуализацией. Основное преимущество методики заключается в высоком пространственно-временном разрешении, при котором приобретается микротрубочка цитоскелет. Он уникален для моделей инвазии рака мозга in vivo и позволяет проводить углубленный анализ динамики микротрубочек.
Субклеточная визуализация инвазии раковых клеток головного мозга in situ может быть использована для анализа любого белка, представляющего интерес, потенциально участвующего в инвазии рака. Для начала промыть клетки глиобластомы, культивируемые при 37 градусах Цельсия, PBS. Отделите клетки, добавив один миллилитр 0,05% трипсина ЭДТА и инкубируя в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия в клеточном инкубаторе, пока все клетки не будут полностью отделены.
Повторное суспендирование клеток в пяти миллилитрах полной клеточной среды глиобластомы в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Добавьте 45 миллилитров ледяного холода PBS и центрифугу в 134 раза G в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки одним миллилитром ледяного PBS путем тщательной пипетки вверх и вниз.
Добавьте еще 49 миллилитров ледяного холода PBS и центрифугу в 134 раза G в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах ледяного PBS. Хранить на льду на время процедуры трансплантации.
Чтобы микроинъецировать клетки глиобластомы в личинки рыбок данио в среднем мозге, заполните микроинъекционную литую пластину шестью миллилитрами среды E3, дополненной 160 миллиграммами на литр трицина. Перенесите дюжину личинок DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED в микроинъекционную пластину. Как только личинки обезболиваются и полностью не реагируют на прикосновения, выравнивайте их в траншеях на боку, головой вверх и желточным мешочком прижимают к стене траншеи с помощью кисти размера 00.
Затем загрузите пять микролитров клеток глиобластомы в микрокапилляр с помощью микрозагружающих наконечников и вставьте капилляр в универсальный капиллярный держатель. Поместите микроинъекционную пластину, содержащую обезболенных личинок, на ступень стереомикроскопа. Поместите кончик микрокапилляра на границу микроинъекционной пластины с помощью ручек микроманипулятора.
Затем разбейте его скальпелем, чтобы создать резкую точку входа размером примерно с диаметр ячейки. Убедитесь, что клетки вытекают из капилляра, осторожно запуская масло в микроинжектор и погружая кончик иглы в среду. Сконцентрируйте клетки на кончике капилляра, чтобы максимизировать количество клеток, вводимых на каждый введенный объем, и избежать заполнения ткани мозга PBS.
Внимательно изучите клетки, выходящие из микрокапилляра, так как масло вручную вводится в инжектор. Определите эмпирически количество оборотов, необходимое на ручной ручке для подачи от 20 до 50 ячеек. Как правило, если клетки достаточно сконцентрированы, достаточно одного мягкого поворота, чтобы извлечь примерно 10 клеток.
Подойдите к кончику капилляра против левого зрительного тектума чуть выше средней мозговой вены. Осторожно прижмите капилляр к личинкам до тех пор, пока оболочка кожи не сломается. Как только будет достигнуто подходящее положение в зрительном тектуме, выбросьте клетки.
Внимательно наблюдайте за кончиком капилляра, чтобы визуализировать поток клеток, идущих внутрь животного, тем самым обеспечивая успешную инъекцию. Повторите процедуру для такого количества животных, сколько потребуется. В зависимости от того, насколько быстро экспериментатор вводит инъекцию, может потребоваться смена иглы каждые 10-20 личинок из-за быстрого скопления клеток в капилляре.
Как только трансплантация ксено будет завершена, удалите личинки из пластины микроинъекции и выделите их в 24-луночной пластине, заполненной минеральной исходной водой PTU и метиленовой синей средой. Приготовьте 1% раствор AH-KROH с низким содержанием плавления. Переложите 500 микролитров кипяченого 1% низкоплавкого раствора AH-KROH в 1,5-миллилитрную центрифужную трубку и дайте ему остыть при 37 градусах Цельсия на тепловом блоке.
добавьте 160 мкг на литр трицина в AH-KROHS и хорошо перемешайте. Переложите от одной до четырех ксенотрансплантированных личинок в 3,5-сантиметровую чашку Петри, наполненную минеральной исходной водой PTU и метиленовой средой, дополненной 160 микрограммами на литр трицина. Как только личинки будут обезболены и полностью не будут реагировать на прикосновения, осторожно перенесите их в трубку, содержащую AH-KROHS и трикаин, используя тонкую передаточную пипетку.
Аккуратно смешайте личинку с AH-KROHS. Используя большую перекладочную пипетку, поместите личинки, смешанные в AH-KROHS, на центр стеклянной нижней 3,5-сантиметровой видеокартины Под стереомикроскопом быстро расположите личинок на спине. С помощью микрозагрузочного наконечника удалите лишние AH-KROHS для поддержания максимально тонкого слоя AH-KROHS.
Как только AH-KROHS затвердеет, добавьте 2,5 миллилитра среды визуализации. Для визуализации in vivo в реальном времени динамики микротрубочек в вторгшихся клетках глиобластомы поместите видеоизображающую тарелку, содержащую встроенные ксенотрансплантированные личинки AH-KROHS, в камеру окружающей среды перевернутого конфокального микроскопа с температурой, установленной на уровне 32 градусов цельсия. Найдите личинок в видеовыпускной тарелке с 10-кратным объективом, используя моторизованную ступень XY.
Нажмите escape, чтобы опустить башню цели и добавить минеральное масло на 60-кратный масляный объектив, и нажмите escape, чтобы вернуться в исходное фокусное положение. Наблюдайте за вторгающимися клетками глиобластомы в красном канале, установленном на 561 нанометровом лазерном источнике, 20% мощности лазера и временном воздействии 200 миллисекунд. Затем выбирают ячейку с распростертой сетью микротрубочек и легко различимыми нитями микротрубочек.
Установите параметры серии Z. Используя пьезоступенчатый диапазон 200 микрометров, выберите верхнюю и нижнюю позиции сети микротрубочек, где Z-стека глубиной от 10 до 30 микрометров достаточно для визуализации микробной сети в выступе мигрирующей клетки с шагом Z-среза 0,3 микрометра. Установите параметры замедленной съемки, чтобы обеспечить оптимальный баланс между скоростью захвата, глубиной Z-стека и флуоресцентным сигналом, чтобы избежать быстрого отбеливания фотографий.
Получайте изображения микротрубочек каждые пять-10 секунд в течение нескольких минут и сохраняйте гиперстек 5D. Динамика микротрубочек измерялась путем построения кимографа вдоль растущих и уменьшающихся микротрубочек и ручного отслеживания отдельных краев микротрубочек с течением времени. Лекарственное лечение, вводимое в личиночную среду, и его обратимое влияние на организацию сети микротрубочек оценивали путем лечения 200 наномолярной дозой нокодазола.
Это привело к прогрессирующему усадке сети микротрубочек и исчезновению протрузии клеток глиобластомы через четыре часа. Вымывание препарата восстановило способность клеток глиобластомы образовывать протрузии. Клетки возобновили миграцию вдоль сосудистой системы через 12 часов после вымывания, что указывает на то, что дозировка нокодазола в 200 наномолей была достаточной, чтобы нарушить сеть микротрубочек и быстро блокировать инвазию клеток глиобластомы in vivo.
Трехдневный анализ того же лечения глобальной инвазии клеток глиобластомы показал, что нокодазол остановил долгосрочную инвазию клеток глиобластомы in vivo, не влияя на общее состояние здоровья рыб по сравнению с контрольной группой. Не забудьте начать со здоровых трехдневных личинок после оплодотворения, чтобы сконцентрировать клетки в капилляре, минимизировать объем, вводимый в мозг, и сформировать уникальную опухолевую массу, и старайтесь избегать инъекций в желудочки мозга.
