Este método está dedicado a la investigación del papel de los microtúbulos durante la invasión del cáncer cerebral mediante el acoplamiento de la inyección atópica de células de cáncer cerebral en el pez cebra a la imagen intravital subcelular. La principal ventaja de la técnica radica en la alta resolución temporal espacial a la que se adquiere el citoesqueleto de microtúbulos. Es único para modelos de invasión de cáncer cerebral in vivo y permite un análisis profundo de la dinámica de los microtúbulos.
Las imágenes subcelulares de la invasión de células cancerosas cerebrales in situ se pueden utilizar para el análisis de cualquier proteína de interés potencialmente involucrada en la invasión del cáncer. Para comenzar, lave las células de glioblastoma cultivadas a 37 grados centígrados con PBS. Separe las células agregando un mililitro de 0.05% de tripsina EDTA e incubando durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados en la incubadora de células hasta que todas las células estén completamente separadas.
Resuspender las células en cinco mililitros de medio celular de glioblastoma completo en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Agregue 45 mililitros de PBS helado y centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con un mililitro de PBS helado pipeteando hacia arriba y hacia abajo a fondo.
Agregue otros 49 mililitros de PBS helado y centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 200 microlitros de PBS helado. Almacenar en hielo durante el procedimiento de trasplante.
Para microinyectar las células de glioblastoma en el mesencéfalo de las larvas de pez cebra, llene una placa de fundición de microinyección con seis mililitros de medio E3 suplementado con 160 miligramos por litro de tricaína. Transfiera una docena de larvas DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED a la placa de microinyección. Una vez que las larvas están anestesiadas y totalmente insensibles al tacto, alinearlas en las zanjas de lado, con la cabeza hacia arriba y el saco vitelino empujado contra la pared de la zanja con un pincel de tamaño 00.
Luego cargue cinco microlitros de células de glioblastoma en el microcapilar usando puntas de microcarga e inserte el capilar en el soporte capilar universal. Coloque la placa de microinyección que contiene las larvas anestesiadas en la etapa de microscopio estéreo. Coloque la punta del microcapilar en el borde de la placa de microinyección utilizando las perillas del micromanipulador.
Luego divídalo con un bisturí para crear un punto de entrada afilado aproximadamente del tamaño del diámetro de una célula. Verifique que las células fluyan fuera del capilar haciendo correr suavemente el aceite en el microinyector y hundiendo la punta de la aguja en el medio. Concentre las células en la punta del capilar para maximizar el número de células inyectadas por volumen inyectado y evite llenar el tejido cerebral con PBS.
Examine cuidadosamente las células que salen del microcapilar a medida que el aceite se introduce manualmente en el inyector. Defina empíricamente el número de vueltas necesarias en la perilla manual para entregar de 20 a 50 celdas. Por lo general, si las células están lo suficientemente concentradas, un giro suave es suficiente para expulsar aproximadamente 10 células.
Acérquese la punta del capilar contra el tectum óptico izquierdo justo por encima de la vena cerebral media. Presione suavemente el capilar contra las larvas hasta que la membrana de la piel se rompa. Una vez alcanzada una posición adecuada en el tectum óptico, expulsar las células.
Observe cuidadosamente la punta del capilar para visualizar la corriente de células que van dentro del animal, asegurando así una inyección exitosa. Repita el procedimiento para tantos animales como sea necesario. Dependiendo de qué tan rápido esté el experimentador en la inyección, podría ser necesario un cambio de aguja cada 10 a 20 larvas debido a la rápida aglutinación celular en el capilar.
Una vez que se complete el trasplante de xeno, retire la larva de la placa de microinyección y selecciónela en una placa de 24 pocillos llena de PTU de agua de fuente mineral y medio azul de metileno. Prepare una solución AH-KROH de bajo punto de fusión al 1%. Transfiera 500 microlitros de solución hervida de AH-KROH de bajo punto de fusión al 1% a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, y deje que se enfríe a 37 grados centígrados en un bloque de calor.
agregue 160 microgramos por litro de tricaína al AH-KROHS y mezcle bien. Transfiera de una a cuatro larvas xenoinjertadas a una placa de Petri de 3,5 centímetros llena de PTU de agua mineral y medio de metileno complementado con 160 microgramos por litro de tricaína. Una vez que la larva esté anestesiada y no responda completamente al tacto, transfiéralas cuidadosamente al tubo que contiene AH-KROHS y tricaína usando una pipeta de transferencia de punta fina.
Mezclar suavemente la larva con el AH-KROHS. Usando una pipeta de transferencia de bulbo grande, coloque las larvas mezcladas en el AH-KROHS en el centro de una antena de imágenes de video de 3,5 centímetros con fondo de vidrio Bajo un microscopio estereoscópico, coloque rápidamente las larvas sobre su espalda. Usando una punta de microcarga, elimine AH-KROHS adicional para mantener la capa AH-KROHS más delgada posible.
Una vez que AH-KROHS se haya solidificado, agregue 2.5 mililitros de medio de imagen. Para la obtención de imágenes en vivo in vivo de la dinámica de los microtúbulos en células invasoras de glioblastoma, coloque la antena de imágenes de video que contiene las larvas xenoinjertadas incrustadas en AH-KROHS en la cámara ambiental de un microscopio confocal invertido con una temperatura establecida en 32 grados centígrados. Encuentra las larvas en el plato de imágenes de video con un objetivo 10x usando una etapa XY motorizada.
Presione escape para bajar la torreta de objetivos y agregue aceite mineral a un objetivo de aceite 60x, y presione escape para volver a la posición focal inicial. Observe las células invasoras de glioblastoma en el canal rojo establecido en una fuente láser de 561 nanómetros, 20% de potencia láser y una exposición temporal de 200 milisegundos. Luego seleccione una celda con una red de microtúbulos extendida y filamentos de microtúbulos fácilmente distinguibles.
Establezca la configuración de la serie Z. Usando una etapa piezoeléctrica de rango de 200 micrómetros, seleccione las posiciones superior e inferior de la red de microtúbulos donde una pila Z de 10 a 30 micrómetros de profundidad es suficiente para visualizar la red microbiana en la protuberancia de la célula migratoria con un paso de corte Z de 0.3 micrómetros. Establezca la configuración de adquisición de lapso de tiempo para permitir un equilibrio óptimo entre la velocidad de adquisición, la profundidad de la pila Z y la señal fluorescente para evitar el blanqueo rápido de las fotos.
Adquiera imágenes de los microtúbulos cada cinco a 10 segundos durante varios minutos y guarde la hiperpila 5D. La dinámica de los microtúbulos se midió mediante la construcción de un timógrafo a lo largo del crecimiento y la contracción de los microtúbulos y el seguimiento manual de los bordes individuales de los microtúbulos a lo largo del tiempo. El tratamiento farmacológico administrado en el medio larvario y su efecto reversible sobre la organización de la red de microtúbulos se evaluó mediante el tratamiento con una dosis de 200 nanomolares de nocodazol.
Esto condujo a la contracción progresiva de la red de microtúbulos y la desaparición de la protrusión de las células de glioblastoma después de cuatro horas. El lavado del fármaco restauró la capacidad de las células de glioblastoma para formar protuberancias. Las células reanudaron la migración a lo largo de la vasculatura 12 horas después del lavado, lo que indica que una dosis de 200 nanomoles de nocodazol fue suficiente para interrumpir la red de microtúbulos y bloquear rápidamente la invasión de células de glioblastoma in vivo.
Un análisis de tres días del mismo tratamiento en la invasión global de células de glioblastoma reveló que el nocodazol detuvo la invasión de células de glioblastoma a largo plazo in vivo sin afectar la salud general de los peces en comparación con un control. Recuerde comenzar con larvas sanas tres días después de la fertilización para concentrar las células en el capilar, minimizar el volumen inyectado en el cerebro y formar una masa tumoral única, y trate de evitar la inyección en los ventrículos cerebrales.
