هذه الطريقة مخصصة للتحقيق في دور الأنابيب الدقيقة أثناء غزو سرطان الدماغ عن طريق اقتران الحقن التأتبي لخلية سرطان الدماغ في الزرد بالتصوير داخل الخلايا تحت الخلوية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الدقة الزمنية المكانية العالية التي يتم فيها الحصول على الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة. إنه فريد من نوعه لنماذج غزو سرطان الدماغ في الجسم الحي ويسمح بتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بعمق.
يمكن استخدام التصوير تحت الخلوي لغزو خلايا سرطان الدماغ في الموقع لتحليل أي بروتين مهم يحتمل أن يكون متورطا في غزو السرطان. للبدء ، اغسل خلايا الورم الأرومي الدبقي المزروعة عند 37 درجة مئوية باستخدام PBS. افصل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من 0.05٪ تربسين EDTA واحتضانها لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخلايا حتى يتم فصل جميع الخلايا بالكامل.
أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من وسط خلية الورم الأرومي الدبقي الكامل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. أضف 45 ملليلترا من PBS البارد المثلج وأجهزة الطرد المركزي عند 134 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا بملليلتر واحد من PBS المثلج البارد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل جيدا.
أضف 49 ملليلترا أخرى من PBS البارد وأجهزة الطرد المركزي عند 134 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS البارد الجليدي. تخزينها على الجليد طوال مدة إجراء الزرع.
للحقن الدقيق لخلايا الورم الأرومي الدبقي في الدماغ المتوسط ليرقات الزرد ، املأ صفيحة مصبوبة بالحقن الدقيق بستة ملليلتر من وسط E3 مع 160 ملليغرام لكل لتر من التريكائين. انقل عشرات يرقات DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED إلى صفيحة الحقن المجهري. بمجرد تخدير اليرقة وعدم استجابتها تماما للمس ، قم بمحاذاتها في الخنادق على جانبها ، ورأسها لأعلى ودفع كيس الصفار على جدار الخندق بفرشاة رسم مقاس 00.
ثم قم بتحميل خمسة ميكرولتر من خلايا الورم الأرومي الدبقي في الشعيرات الدموية الدقيقة باستخدام نصائح التحميل الدقيق وأدخل الشعيرات الدموية في حامل الشعيرات الدموية العالمي. ضع صفيحة الحقن المجهري التي تحتوي على اليرقات المخدرة على مرحلة مجهر الاستريو. ضع طرف الشعيرات الدموية الدقيقة على حدود لوحة الحقن الدقيق باستخدام مقابض المناور الدقيقة.
ثم كسرها بمشرط لإنشاء نقطة دخول حادة بحجم قطر الخلية تقريبا. تحقق من أن الخلايا تتدفق من الشعيرات الدموية عن طريق تشغيل الزيت برفق في الحاقن الدقيق وإغراق طرف الإبرة في الوسط. ركز الخلايا عند طرف الشعيرات الدموية لزيادة عدد الخلايا المحقونة لكل حجم يتم حقنه وتجنب ملء أنسجة المخ ب PBS.
افحص بعناية الخلايا الخارجة من الشعيرات الدموية الدقيقة حيث يتم إدخال الزيت يدويا في الحاقن. حدد تجريبيا عدد الدورات اللازمة على المقبض اليدوي لتوصيل 20 إلى 50 خلية. عادة ، إذا كانت الخلايا مركزة بدرجة كافية ، فإن دورة واحدة لطيفة تكفي لإخراج ما يقرب من 10 خلايا.
اقترب من طرف الشعيرات الدموية ضد الحاجز البصري الأيسر فوق الوريد الدماغي الأوسط مباشرة. اضغط برفق على الشعيرات الدموية ضد اليرقات حتى ينكسر غشاء الجلد. بمجرد الوصول إلى موضع مناسب في الحاجز البصري ، أخرج الخلايا.
راقب بعناية طرف الشعيرات الدموية لتصور تيار الخلايا التي تدخل داخل الحيوان وبالتالي ضمان الحقن الناجح. كرر الإجراء لأكبر عدد ممكن من الحيوانات حسب الحاجة. اعتمادا على مدى سرعة المجرب في الحقن ، قد تكون هناك حاجة لتغيير الإبرة كل 10 إلى 20 يرقة بسبب التكتل السريع للخلايا في الشعيرات الدموية.
بمجرد اكتمال عملية زرع xeno ، قم بإزالة اليرقة من لوحة الحقن الدقيق وفردها في صفيحة 24 بئر مملوءة بمياه مصدر معدني PTU ووسط أزرق الميثيلين. تحضير محلول AH-KROH منخفض الانصهار بنسبة 1٪. انقل 500 ميكرولتر من محلول AH-KROH المغلي منخفض الانصهار بنسبة 1٪ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر ، واتركه يبرد عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية.
أضف 160 ميكروغرام لكل لتر من التريكائين إلى AH-KROHS واخلطه جيدا. انقل واحدة إلى أربع يرقات مطعمة بالأجانب إلى طبق بتري 3.5 سم مملوء بمياه مصدر معدني PTU ووسط الميثيلين يكمله 160 ميكروغرام لكل لتر من التريكائين. بمجرد تخدير اليرقة وعدم استجابتها تماما للمس، قم بنقلها بعناية إلى الأنبوب الذي يحتوي على AH-KROHS والتريكائين باستخدام ماصة نقل ذات طرف رفيع.
امزج اليرقة بلطف مع AH-KROHS. باستخدام ماصة نقل لمبة كبيرة ، ضع اليرقات المخلوطة في AH-KROHS على مركز طبق تصوير فيديو ذو قاع زجاجي 3.5 سم تحت مجهر ستيريو ضع اليرقات بسرعة على ظهرها. باستخدام طرف تحميل دقيق ، قم بإزالة AH-KROHS الإضافي للحفاظ على أنحف طبقة AH-KROHS ممكنة.
بمجرد أن تصلب AH-KROHS ، أضف 2.5 ملليلتر من وسيط التصوير. بالنسبة للتصوير الحي في الجسم الحي ، لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي الغازية ، ضع طبق التصوير بالفيديو الذي يحتوي على يرقات AH-KROHS المطعمة بالأشعة السينية المضمنة في الغرفة البيئية لمجهر متحد البؤر مقلوب مع درجة حرارة محددة عند 32 درجة مئوية. ابحث عن اليرقات في طبق تصوير الفيديو بهدف 10x باستخدام مرحلة XY الآلية.
اضغط على الهروب لخفض برج الأهداف وإضافة الزيت المعدني على هدف زيت 60x ، واضغط على الهروب للعودة إلى الوضع البؤري الأولي. راقب خلايا الورم الأرومي الدبقي الغازية في القناة الحمراء المحددة على مصدر ليزر 561 نانومتر ، وطاقة ليزر 20٪ ، وتعرض زمني يبلغ 200 مللي ثانية. ثم حدد خلية ذات شبكة أنابيب دقيقة منتشرة وخيوط الأنابيب الدقيقة التي يمكن تمييزها بسهولة.
اضبط إعدادات السلسلة Z. باستخدام مرحلة بيزو بنطاق 200 ميكرومتر ، حدد المواضع العلوية والسفلية لشبكة الأنابيب الدقيقة حيث يكفي مكدس Z بعمق 10 إلى 30 ميكرومتر لتصور الشبكة الميكروبية في نتوء الخلية المهاجرة بخطوة شريحة Z تبلغ 0.3 ميكرومتر. اضبط إعدادات اكتساب الفاصل الزمني للسماح بالتوازن الأمثل بين سرعة الاكتساب وعمق Z-stack وإشارة الفلورسنت لتجنب التبييض السريع للصور.
الحصول على صور من الأنابيب الدقيقة كل خمس إلى 10 ثوان لعدة دقائق وحفظ 5D hyper-stack. تم قياس ديناميكيات الأنابيب الدقيقة عن طريق بناء كيموغراف على طول الأنابيب الدقيقة المتنامية والمتقلصة وتتبع حواف الأنابيب الدقيقة الفردية يدويا بمرور الوقت. تم تقييم العلاج الدوائي الذي يتم إعطاؤه في وسط اليرقة وتأثيره العكسي على تنظيم شبكة الأنابيب الدقيقة من خلال العلاج بجرعة 200 نانومولار من نوكودازول.
أدى ذلك إلى انكماش تدريجي لشبكة الأنابيب الدقيقة واختفاء نتوء خلايا الورم الأرومي الدبقي بعد أربع ساعات. غسل الدواء استعادة قدرة خلايا الورم الأرومي الدبقي لتشكيل نتوءات. استأنفت الخلايا الهجرة على طول الأوعية الدموية بعد 12 ساعة من الغسل مما يشير إلى أن جرعة 200 نانومول من نوكودازول كانت كافية لتعطيل شبكة الأنابيب الدقيقة ومنع غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي في الجسم الحي بسرعة.
كشف تحليل لمدة ثلاثة أيام لنفس العلاج على غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي العالمي أن نوكودازول أوقف غزو خلايا الورم الأرومي الدبقي على المدى الطويل في الجسم الحي دون التأثير على الصحة العامة للأسماك مقارنة بالسيطرة. تذكر أن تبدأ بثلاثة أيام صحية بعد الإخصاب من اليرقات لتركيز الخلايا في الشعيرات الدموية ، لتقليل الحجم المحقون في الدماغ ، وتشكيل كتلة ورم فريدة ، ومحاولة تجنب الحقن في البطينين الدماغيين.
