Bu yöntem, zebra balığındaki beyin kanseri hücresinin atopik enjeksiyonunu hücre altı intravital görüntülemeye bağlayarak beyin kanseri invazyonu sırasında mikrotübüllerin rolünün araştırılmasına adanmıştır. Tekniğin temel avantajı, mikrotübül sitoiskeletinin elde edildiği yüksek uzamsal zamansal çözünürlükte yatmaktadır. İn vivo beyin kanseri invazyon modelleri için benzersizdir ve derinlemesine mikrotübül dinamiği analizine izin verir.
İn situ beyin kanseri hücre invazyonunun hücre altı görüntülemesi, kanser invazyonunda potansiyel olarak yer alan herhangi bir proteinin analizi için kullanılabilir. Başlamak için, 37 santigrat derecede kültürlenmiş glioblastoma hücrelerini PBS ile yıkayın. Bir mililitre% 0.05 Tripsin EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve tüm hücreler tamamen ayrılana kadar hücre inkübatöründe 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin.
Hücreleri, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde beş mililitre tam glioblastoma hücre ortamında yeniden askıya alın. 45 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 134 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile yukarı ve aşağı iyice pipetleyerek yeniden askıya alın.
49 mililitre daha buz gibi soğuk PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 134 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri 200 mikrolitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Transplantasyon prosedürü boyunca buz üzerinde saklayın.
Glioblastoma hücrelerini zebra balığı larvalarının orta beynine mikro olarak enjekte etmek için, bir mikroenjeksiyon döküm plakasını, litre trikain başına 160 miligram ile desteklenmiş altı mililitre E3 ortamı ile doldurun. Bir düzine DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED larvasını mikroenjeksiyon plakasına aktarın. Larva anestezi altına alındıktan ve dokunmak için tamamen tepkisiz kaldıktan sonra, onları yanlarındaki siperlere hizalayın, baş yukarı ve yumurta sarısı kesesi 00 büyüklüğünde bir boya fırçası ile açmanın duvarına doğru itilir.
Daha sonra mikro yükleme uçlarını kullanarak beş mikrolitre glioblastoma hücresini mikro kılcal damara yükleyin ve kılcal damarı üniversal kılcal tutucuya yerleştirin. Anestezi uygulanan larvaları içeren mikroenjeksiyon plakasını stereo mikroskop aşamasına yerleştirin. Mikro manipülatör düğmelerini kullanarak mikro kılcal damarın ucunu mikroenjeksiyon plakasının sınırına yerleştirin.
Ardından, kabaca bir hücrenin çapının büyüklüğünde keskin bir giriş noktası oluşturmak için bir neşterle kırın. Mikro enjektörde hafifçe yağ akarak ve iğnenin ucunu ortama daldırarak hücrelerin kılcal damardan aktığını doğrulayın. Enjekte edilen hacim başına enjekte edilen hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak ve beyin dokusunu PBS ile doldurmaktan kaçınmak için hücreleri kılcal damarın ucunda yoğunlaştırın.
Mikro kılcal damardan çıkan hücreleri dikkatlice inceleyin, çünkü yağ enjektöre manuel olarak verilir. 20 ila 50 hücre iletmek için manuel düğmede gereken dönüş sayısını ampirik olarak tanımlayın. Tipik olarak, hücreler yeterince konsantre olursa, yaklaşık 10 hücreyi çıkarmak için yumuşak bir dönüş yeterlidir.
Kılcal damarın ucuna orta serebral venin hemen üstündeki sol optik tektuma doğru yaklaşın. Cilt zarı kırılana kadar kılcal damarı larvalara karşı hafifçe bastırın. Optik tektumda uygun bir konuma ulaşıldığında, hücreleri dışarı atın.
Hayvanın içine giren hücre akışını görselleştirmek için kılcal damarın ucunu dikkatlice gözlemleyin, böylece başarılı bir enjeksiyon sağlayın. Prosedürü gerektiği kadar hayvan için tekrarlayın. Deneycinin enjekte etmede ne kadar hızlı olduğuna bağlı olarak, kılcal damardaki hızlı hücre kümelenmesi nedeniyle her 10 ila 20 larvada bir iğne değişimine ihtiyaç duyulabilir.
Xeno transplantasyonu tamamlandıktan sonra, larvaları mikroenjeksiyon plakasından çıkarın ve mineral kaynak suyu PTU ve metilen mavisi ortamı ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir plakada ayırın. % 1 düşük erime AH-KROH çözeltisi hazırlayın. 500 mikrolitre kaynamış% 1 düşük erime AH-KROH çözeltisini 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir ısı bloğu üzerinde 37 santigrat derecede soğumaya bırakın.
AH-KROHS'a litre trikain başına 160 mikrogram ekleyin ve iyice karıştırın. Bir ila dört ksenograflanmış larvayı, mineral kaynak suyu PTU ve metilen ortamı ile doldurulmuş 3.5 santimetrelik bir Petri kabına aktarın ve litre trikain başına 160 mikrogram ile tamamlayın. Larva anestezi altına alındıktan ve dokunmaya tamamen tepkisiz kaldıktan sonra, ince uçlu bir transfer pipeti kullanarak AH-KROHS ve trikain içeren tüpe dikkatlice aktarın.
Larvaları AH-KROHS ile yavaşça karıştırın. Büyük bir ampul transfer pipeti kullanarak, AH-KROHS'ta karıştırılmış larvaları, cam tabanlı 3,5 santimetrelik bir video görüntüleme kabının ortasına yerleştirin Stereo mikroskop altında larvaları hızlı bir şekilde sırtına yerleştirin. Bir mikro yükleme ucu kullanarak, mümkün olan en ince AH-KROHS tabakasını korumak için ekstra AH-KROHS'yi çıkarın.
AH-KROHS katılaştıktan sonra, 2,5 mililitre görüntüleme ortamı ekleyin. İnvaziv glioblastoma hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerinin in vivo canlı görüntülenmesi için, AH-KROHS gömülü ksenograflanmış larvaları içeren video görüntüleme kabını, 32 santigrat dereceye ayarlanmış bir sıcaklığa sahip ters çevrilmiş bir konfokal mikroskobun çevre odasına yerleştirin. Video görüntüleme kabındaki larvaları, motorlu bir XY aşaması kullanarak 10x objektifle bulun.
Hedef taretini alçaltmak ve 60x yağ hedefine mineral yağ eklemek için escape tuşuna basın ve ilk odak konumuna geri dönmek için escape tuşuna basın. 561 nanometre lazer kaynağında,% 20 lazer gücünde ve% 200 milisaniyelik bir zaman maruziyetinde ayarlanan kırmızı kanaldaki istilacı glioblastoma hücrelerini gözlemleyin. Ardından, yayılmış bir mikrotübül ağına ve kolayca ayırt edilebilir mikrotübül filamentlerine sahip bir hücre seçin.
Z serisi ayarlarını yapın. 200 mikrometre aralığında piezo aşaması kullanarak, göç eden hücrenin çıkıntısındaki mikrobiyal ağı 0.3 mikrometrelik bir Z dilimi adımıyla görselleştirmek için 10 ila 30 mikrometre derinliğinde bir Z yığınının yeterli olduğu mikrotübül ağının üst ve alt konumlarını seçin. Hızlı fotoğraf ağartmasını önlemek için alım hızı, Z-yığını derinliği ve floresan sinyali arasında optimum bir denge sağlamak için hızlandırılmış alma ayarlarını yapın.
Birkaç dakika boyunca her beş ila 10 saniyede bir mikrotübüllerin görüntülerini alın ve 5B hiper yığını kaydedin. Mikrotübül dinamikleri, büyüyen ve küçülen mikrotübüller boyunca kimograf inşa edilerek ve zaman içinde bireysel mikrotübül kenarlarını manuel olarak izleyerek ölçüldü. Larva ortamında uygulanan ilaç tedavisi ve mikrotübüller ağ organizasyonu üzerindeki geri dönüşümlü etkisi, 200 nanomolar nokodazol dozu ile tedavi edilerek değerlendirildi.
Bu, mikrotübül ağının ilerleyici büzülmesine ve dört saat sonra glioblastoma hücre çıkıntısının kaybolmasına yol açtı. İlacın yıkanması, glioblastoma hücrelerinin çıkıntı oluşturma kapasitesini geri kazandırdı. Hücreler, yıkamadan 12 saat sonra vaskülatür boyunca göç etmeye devam ettiler, bu da 200 nanomol nokodozol dozajının mikrotübül ağını bozmak ve in vivo glioblastoma hücre invazyonunu hızla bloke etmek için yeterli olduğunu gösterdi.
Global glioblastoma hücre invazyonu üzerine aynı tedavinin üç gün süren bir analizi, nokodazolün uzun süreli glioblastoma hücre invazyonunu in vivo olarak balıkların genel sağlığını etkilemeden durdurduğunu ortaya koymuştur. Hücreleri kılcal damara konsantre etmek, beyne enjekte edilen hacmi en aza indirmek ve benzersiz bir tümör kütlesi oluşturmak için döllenmeden üç gün sonra sağlıklı larvalarla başlamayı unutmayın ve beyin ventriküllerine enjekte etmekten kaçınmaya çalışın.
