סינפסות הן היחידות החישוביות הבסיסיות של המוח. השיטה המוצגת היא כלי פשוט ובעל ערך לחקר הסינפסות והתהליכים המולקולריים שלהן וגם להבנת האופן שבו הן עשויות להשתנות בהפרעות מוחיות שונות. טכניקה זו כוללת שבירה של מבנים סינפטוזומים מבודדים מהמוח.
זה מאפשר לחוקר ללכוד אפקטים שעשויים להיות ממודרים בסינפסה. ניתן לנתח גם את רמות ההתפלגות והפעילות של חלבונים ספציפיים ברזולוציה תת-סינפטית. הליך זה לוקח בערך 11 שעות עבור חוקר בודד להשלים אם הכל הולך בצורה חלקה.
אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו עשוי להתקשות עם אורך הליך זה כפי שהוא באופן טבעי ייקח קצת יותר זמן עבור מישהו שאינו מכיר את השלבים. בגלל אורכו של יום ניסוי זה, אנו ממליצים בחום לבצע את הנתיחות עם שותף שיכול לעזור לך להקל על איסוף רקמות מהיר כדי להבטיח שלא יהיו דגימות על הקרח למשך זמן רב יותר מהנדרש. אנו ממליצים גם להכין מאגרים וחומרים עליונים ביום שלפני הפעלת ניסוי זה, כך שהכל יהיה בהישג יד בעת הצורך.
זה נכון במיוחד עבור צינורות האיסוף. אליקוטים מרובים של סך של 11 שברים תת-תאיים ייאספו עד סוף הליך זה. אז העובדה שהצינורות האלה מסומנים בבירור מראש תהפוך את היום שלך להרבה יותר קל.
כדי להתחיל, הכנס מספריים עדינים מתחת לעור בחתך העריפה לעומק גולגולתי פרי ובצע חתך סגיטלי אמצעי עד לתפר התוך-שרידי כדי להחזיר את הקרקפת מהגולגולת. בעבודה מהאזור העורפי לכיוון כל היבט טמפורלי, חותכים את החיתולית והשריר כדי לחשוף את פני השטח החיצוניים של הגולגולת מעבר לכל בשר אקוסטי חיצוני. הדקו את הקרקפת ואת ההיבט הרוסטרלי של הגולגולת ביד הלא דומיננטית וביד השנייה, החדירו מספריים עדינים שני מילימטרים לתוך הצד הקאודאלי של הפורמן מגנום שבו חוט השדרה נראה יוצא.
בצע חתך בקו האמצע עד שהמספריים מגיעים לפני השטח הפנימיים של העצם התוך-קודקודית. שנה את זווית המספריים כך שהלהבים יפעלו במקביל למשטח הגבי של הגולגולת. ממשיכים לקדם את החתך המידסגיטלי דרך העצמות הקודקודיות והפרונטליות תוך שימוש בתפרים הסגיטליים והאינטרפרונטליים כמדריך ומסיימים את החתך ממש מעבר לתפר הבין-סנסלי.
לאחר מכן, בצע חתך מאונך של שלושה מילימטרים לעצם האף, רוסטרלי לתפר הבין-נקבי, על ידי הנחת המספריים בניצב לגולגולת כאשר כל להב ממוקם בתפר קדם-מקסילרי באף והפיכת חתך אחד אחיד. תוך שמירה על ההיבט הרוסטרלי, השתמש בצד אחד של זוג מלקחיים בעלי מרקם כדי להרים בעדינות את הגולגולת מהמוח ולאחר מכן להרים אותה לרוחב ולגחון. חזרו על הפעולה לאורך קו האמצע לפי הצורך, ולאחר מכן בחצי הכדור השני עד שכל פני השטח של המוח נחשפים.
באמצעות מלקחיים מעוקלים או מרית עדינה מרימים בעדינות את הצד הרוסטרלי של המוח. חותכים את עצבי הראייה והגולגולת כדי להשלים את הכריתה מהגולגולת. הומוגניות המוח באמצעות זכוכית מורדת הומוגנייזר המונח על אמבט קרח ב 12 למעלה למטה עובר ב 500 סל"ד.
השהה לזמן קצר בכל מכת מטה כדי להבטיח הומוגניזציה יסודית של הרקמה. מעבירים את המוח הכולל לצינור צנטריפוגה תחתון עגול במהירות גבוהה של 14 מיליליטר ומסובבים אותו ב-800 G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג את הסופר-נטנט המכונה S1.העבר S1 לצינור צנטריפוגה חדש, השליך את הכדור. קח שניים חמישה מיקרוליטר אליקוטים של S1 עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ושני 100 microliter aliquots של S1 עבור הכתם המערבי.
סובב S1 ב 9, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל את supernatant סומלי סינפטי, או S2, ואת גלולה סינפטוזום גס או P2. קח שניים, 10 מיקרוליטר aliquots של S2 עבור בדיקת חומצה bicinchonic ושני 500 microliter aliquots של S2 עבור כתם המערבי. השליכו את הסופר-נאטנט לאחר קבלת האליקוטים. לאחר צנטריפוגה ב 9, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשיג את S2's supernatant ו שטף סינפטוזום, P2'להשליך את supernatant ו resuse P2'in שלושה מיליליטר של חיץ A.הימנע החייאת החלק האדום כהה בתחתית הכדור, אשר מכיל בעיקר מיטוכונדריה.
קח שני 20 מיקרוליטר aliquots של P2'עבור בדיקת חומצה bicinchonic ושני 100 microliter aliquots של P2'עבור הכתם המערבי. עבור התזה היפוטונית של סינפטוזום שטף להוסיף תשעה כרכים של חיץ צונן B כדי להשעות מחדש P2's הומוגניות את הסינפטוזום בכוס למטה הומוגנייזר. מעבירים את הדגימות לצינורות צנטריפוגה חרוטיים בקוטר 50 מיליליטר ומסובבים אותן על אקדח צינור בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
צנטריפוגה P2'at 25, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל את lysis supernatant או LS1, ואת כדור ליזיס המכיל ממברנות סינפטוזומליות, או LP1. קח שניים, 50 מיקרוליטר אליקוטים של LS1 עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ושני 400 microliter aliquots של LS1 עבור הכתם המערבי. העבר את LS1 לתוך צינור צנטריפוגה מכוסה עבור צנטריפוגה אולטרה.
צנטריפוגה LS1 ברוטור אולטרה צנטריפוגה בזווית קבועה ב 100, 000 G במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל ציטוזול סינפטי supernatant, או LS2, וכדור שלפוחית סינפטית, או LP2. יש להשעות את LP2 ב-500 מיקרוליטרים של חיץ A ולהשתמש במחט של 23 מדים ובמזרק של מיליליטר אחד עם טריטורציה עדינה. קח שניים, 10 מיקרוליטר aliquots של LP2 עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ושניים, 250 microliter aliquots של LP2 עבור הכתם המערבי.
מעבירים כ-30 מיליליטר של LS2 ליחידות סינון צנטריפוגליות עם ניתוק של 10 מילי-דלטון ומרכזים את ה-LS2 לכ-0.5 מיליליטר על ידי סיבוב ב-5, 000 גרם למשך עד שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. קח שניים, 10 מיקרוליטר aliquots של LS2 מרוכז עבור הבדיקה bicinchoninic, ושניים, 250 microliter aliquots של LS2 מרוכז עבור הכתם המערבי. יש להשעות את ה-LP1 במיליליטר אחד של חיץ B, ולקחת שניים, 10 מיקרוליטר אליקוטים של LP1 לבדיקת החומצה הביצ'ונית, ו-50 מיקרוליטר אליקוטים של LP1 עבור הכתם המערבי.
התאם את ה-LP1 הנותר לנפח סופי של 7.5 מיליליטר, וריכוז סוכרוז סופי של 1.1 טוחנת עם חיץ B וחיץ C.לאחר מכן העבר 7.5 מיליליטר של LP1 החייאה לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה של 14 מיליליטר. שכב בזהירות את LP1 עם 3.75 מיליליטר של חיץ D וסמן את החלק העליון של התמיסה עם עט. לאחר מכן שכבה עם כ 1.25 מיליליטר של חיץ A.ובאופן דומה לסמן את החלק העליון של התמיסה עם עט.
אזנו את הצינורות להיפר-צנטריפוגה לפי משקל, לא לפי נפח, עם תוספת טיפה של חיץ A ל-10 מיליגרם. צנטריפוגה ב 48, 000 G במשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד אולטרה צנטריפוגה ולקבל תמונות של שיפועים שלמים כדי לתעד את הייחודיות של כל ממשק סוכרוז ואת ההצלחה של פיצול. הסר בזהירות את השכבה השטחית של סוכרוז 320 מילימולאר ושחזר את חלק המיאלין בממשק 320 מילימולר, 855 מילימולאר סוכרוז בנפח 800 מיקרוליטר.
צניחה מדופן הצינורות בצורה מעגלית כדי להבטיח את איסוף החלק השלם. לאחר מכן לשחזר את שבר SPM ב 855 מילימולאר, 1.1 מילימולר סוקרוז ממשק בנפח 1000 מיקרוליטר. שאפו בזהירות את הסוכרוז הנותר ושחזרו את הכדור המיטוכונדריאלי על ידי החייאת 200 מיקרוליטרים של חיץ B.דללו את חלק ה- SPM עם שני נפחים של חיץ B, ולאחר מכן צנטריפוגה ברוטור זווית קבועה בצינור צנטריפוגה של 3.5 מיליליטר.
יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות מחדש את גלולת ה-SPM במאגר A לקבלת נפח סופי של 250 מיקרוליטרים. קח שניים, חמישה מיקרוליטרים aliquots של SPM עבור בדיקת חומצה bicinchoninic ולחלק את SPM הנותרים לשניים עבור כתם מערבי. תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים של סינפטוזום מוצגות באיור זה.
סינפטוזום המכיל שלפוחיות סינפטיות הן מרכיבים קדם-סינפטיים והן רכיבים פוסט-סינפטיים ושלפוחיות סינפטיות במיטוכונדריה מוצגים כאן. ניתוח אימונובלוט של שברים תת-תאיים בוצע כדי להעריך סמנים של טוהר שברים. בהשוואה להומוגנט המוח השלם הראשוני, הניתוח גילה את ההעשרה של n-cadherin בחלק קרום הפלזמה הסינפטית, אלפא סינוקלאין בציטוזול הסינפטי, סינפטופיזין בשבר השלפוחית הסינפטית, וחלבון בסיסי מיאלין בשבר המיאלין.
לאחר קביעת טוהר השברים, ניתן להשתמש באימונובלוטינג כמותי כדי לקבוע את לוקליזציה של חלבונים בעלי עניין, או לשאול הבדלים בהתפלגות החלבונים בין גנוטיפים או טיפולים. בעת ניסיון הליך זה, הקפד להשתמש בכלי זכוכית ללא חומרי ניקוי, כך שניתן יהיה לאסוף סינפטוזום שלם. כמו כן, היזהר בעת הכנת שיפועים של סוכרוז כדי להבטיח שתקבל ממשקים ברורים.
זה יאפשר לך לבודד בהצלחה את שבר קרום פלזמה סינפטי. ניתן לבצע אנליזות מבניות ותפקודיות שונות כדי לסייע לאיכות של שברים סינפטיים כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים, אימונובלוטציה, פרוטאומיקה ושיטות מולקולריות אחרות. שחרור נוירוטרנסמיטר או בדיקות אנזימטיות יכולים להתבצע גם כדי לסייע לכדאיות המטבולית של סינפטוזום.
הבידוד של מבנים סינפטוזומים היה טכניקה לשינוי פרדיגמה לניתוח תפקוד והרכב הסינפסה. כפי שאנו רואים תפקוד סינפטי מוקדם בניוון עצבי, דיסקציה זהירה של שינויים מולקולריים ברמת הסינפסה תעזור לנו לחקור את המנגנונים המולקולריים של הפרעות אלה.
