シナプスは脳の基本的な計算単位です。提示された方法は、シナプスとその分子プロセスを研究し、さまざまな脳障害でそれらがどのように変化するかを理解するためのシンプルで貴重なツールです。この技術は、脳から単離されたシナプトソーム構造の分画を含む。
これにより、研究者はシナプスで区画化される可能性のある効果を捉えることができます。特定のタンパク質の分布レベルと活性もシナプス下分解能で分析できます。この手順は、すべてが順調に進んだ場合、個々の研究者が完了するのに約11時間かかります。
このテクニックを実行したことがない人は、手順に慣れていない人にとっては自然に少し時間がかかるため、この手順の長さに苦労する可能性があります。この実験日は長いため、サンプルが必要以上に氷上にセットされないように、迅速な組織収集を容易にするのに役立つパートナーと一緒に解剖を行うことを強くお勧めします。また、この実験を実行する前日にバッファーとベンチトップ材料を準備して、必要なときにすべてが簡単に手の届くところにあるようにすることをお勧めします。
これは特に収集チューブに当てはまります。合計11の細胞内画分の複数のアリコートが、この手順の終わりまでに収集されます。したがって、これらのチューブに事前に明確にラベルを付けておくと、一日がはるかに簡単になります。
まず、断頭切開部で皮膚の下に細かいハサミを頭蓋周囲の深さまで挿入し、鼻腔内縫合糸まで矢状中切開を行い、頭皮を頭蓋骨から引っ込めます。後頭部から各側頭側面に向かって作業し、筋膜と筋肉をトリミングして、各外部聴道を超えて頭蓋骨の外面を露出させます。利き手ではない手で頭蓋骨の頭皮と吻側の側面を固定し、もう一方の手で、脊髄が出ているのが見える大孔の尾側に2ミリメートルの細かいはさみを挿入します。
はさみが頭頂内骨の内面に到達するまで正中線を切開します。はさみの角度を変更して、ブレードが頭蓋骨の背側表面と平行になるようにします。矢状縫合糸と前頭間縫合糸をガイドとして使用して、頭頂骨と前頭骨を通して中矢状切開を吻側に進め続け、鼻間縫合糸のすぐ向こうで切開を終了します。
次に、鼻上顎前縫合糸に各刃を配置して頭蓋骨に垂直にハサミを配置し、1つを均等に切断することにより、鼻骨に垂直に3ミリメートル、鼻間縫合糸に対して吻側を切開します。吻側を固定しながら、テクスチャー加工された鉗子の片側を使用して、頭蓋骨を脳からそっと持ち上げてから、横方向と腹側に持ち上げます。必要に応じて正中線に沿って繰り返し、次に脳表面全体が露出するまでもう一方の半球についても繰り返します。
湾曲した鉗子または細かいへらを使用して、脳の吻側をそっと持ち上げます。視神経と脳神経を切断して、頭蓋骨からの切除を完了します。500rpmで12回のアップダウンパスで氷浴上に置かれたガラスダウンホモジナイザーを使用して脳を均質化する。
各ダウンストロークで短時間一時停止して、組織の完全な均質化を確実にします。全脳ホモジネートを14ミリリットルの高速丸底遠心管に移し、摂氏4度で800Gで10分間回転させて、S1と呼ばれる上清を得ます。ビシンコニン酸アッセイ用にS1の5マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にS1の100マイクロリットルアリコートを2つ取ります。
S1を摂氏4度で9,000Gで15分間スピンして、シナプスソーム上清またはS2、および粗シナプトソームペレットまたはP2を得た。ビシンコニン酸アッセイ用にS2の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にS2の500マイクロリットルアリコートを2つ取ります。アリコートを得た後、上清を捨てる。摂氏4度で15分間9, 000Gで遠心分離した後、上清S2 ́を得てシナプトソームを洗浄し、P2'上清を廃棄し、P2'を3ミリリットルのバッファーに再懸濁しますA.主にミトコンドリアを含むペレットの底にある暗赤色部分を再懸濁することは避けてください。
ビシンコニン酸アッセイ用に20マイクロリットルのP2'を2つ、ウェスタンブロットにP2'の100マイクロリットルアリコートを2つ取ります。洗浄したシナプトソームの低張溶解のために、9容量のチルドバッファーBを加えてP2'を再懸濁し、グラスダウンホモジナイザーでシナプトソームをホモジナイズします。サンプルを50ミリリットルのキャップ付きコニカル遠心分離機チューブに移し、摂氏4度の冷蔵室でチューブリボルバー上で15分間回転させます。
溶解したP2'を摂氏4度で25, 000Gで20分間遠心分離し、溶解上清またはLS1、およびシナプトソーム膜またはLP1を含む溶解ペレットを得る。ビシンコニン酸アッセイ用にLS1の50マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にLS1の400マイクロリットルアリコートを2つ取ります。LS1をキャップ付き遠沈管に移し、超遠心分離を行います。
LS1を固定角超遠心ローターで100, 000 G、摂氏4度で60分間遠心分離し、シナプス細胞質ゾル上清(LS2)とシナプス小胞ペレット(LP2)を得ます。LP2を500マイクロリットルのバッファーAに再懸濁し、23ゲージの針と1ミリリットルのシリンジを使用してLP2を穏やかな粉砕で行います。ビシンコニン酸アッセイ用にLP2の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にLP2の250マイクロリットルアリコートを2つ取ります。
約30ミリリットルのLS2を10ミリダルトンカットオフの遠心フィルターユニットに移し、摂氏4度で最大1時間5, 000 Gで回転させてLS2を約0.5ミリリットルに濃縮します。ビシンコニンアッセイ用に濃縮LS2の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用に濃縮LS2の250マイクロリットルアリコートを2つ取ります。LP1を1ミリリットルのバッファーBに再懸濁し、ビシンコニン酸アッセイ用にLP1の10マイクロリットルアリコートを2つ、ウェスタンブロット用にLP1の50マイクロリットルアリコートを2つ取ります。
残りのLP1を最終容量7.5ミリリットル、最終スクロース濃度1.1モルに調整し、バッファーBとバッファーCで次に、再懸濁したLP17.5ミリリットルを14ミリリットルの超遠心チューブに移します。LP1を3.75ミリリットルのバッファーDで慎重に覆い、溶液の上部にペンで印を付けます。次に、約1.25ミリリットルのバッファーAをオーバーレイし、同様に溶液の上部にペンで印を付けます。
超遠心分離用のチューブを容量ではなく重量でバランスを取り、バッファーAを10ミリグラム以内に滴下します。スイングバケット超遠心機ローターで摂氏 4 度で 2.5 時間、48 、 000 G で遠心分離し、無傷の勾配の画像を取得して、各スクロース界面の明瞭さと分画の成功を文書化します。320ミリモルスクロースの表面層を注意深く除去し、800マイクロリットルの容量で320ミリモル、855ミリモルスクロース界面のミエリン画分を回収します。
チューブの壁から円形にピペットで持ち上げて、完全な画分を確実に収集します。次に、1000マイクロリットルの容量で855ミリモル、1.1ミリモルのスクロース界面でSPM画分を回収します。残りのスクロースを注意深く吸引し、200マイクロリットルのバッファーBに再懸濁してミトコンドリアペレットを回収し、SPM画分を2倍量のバッファーBで希釈し、3.5ミリリットルの遠心チューブ内の固定角度ローターで遠心分離します。
上清を廃棄し、SPMペレットをバッファーAに再懸濁して、最終容量250マイクロリットルにします。ビシンコニン酸アッセイ用にSPMを2、5マイクロリットルのアリコートに取り、残りのSPMをウェスタンブロット用に半分に分割します。シナプトソームの電子顕微鏡像をこの図に示します。
シナプス前後のシナプス小胞とミトコンドリアのシナプス小胞を含むシナプトソームをここに示します。細胞内画分のイムノブロット分析は、画分純度のマーカーを評価するために行った。初期の全脳ホモジネートと比較すると、シナプス原形質膜画分にn-カドヘリン、シナプス細胞質ゾルにαシヌクレイン、シナプス小胞画分にシナプトフィジン、ミエリン画分にミエリン塩基性タンパク質が濃縮されていることが明らかになりました。
画分の純度が確立されたら、定量的イムノブロッティングを使用して、目的のタンパク質の局在を決定したり、遺伝子型や治療間のタンパク質分布の違いを調べたりすることができます。この手順を試みるときは、無傷のシナプトソームを収集できるように、必ず洗剤を含まないガラス製品を使用してください。また、スクロース勾配を準備する際には、明確な界面が得られるように注意してください。
これにより、シナプス原形質膜画分を正常に分離することができます。電子顕微鏡、イムノブロッティング、プロテオミクス、その他の分子法などのシナプス画分の品質を支援するために、さまざまな構造および機能解析を実行できます。シナプトソームの代謝生存率を補助するために、神経伝達物質の放出または酵素アッセイも実施することができる。
シナプトソーム構造の単離は、シナプスの機能と組成を分析するためのパラダイムシフト技術でした。神経変性における初期のシナプス機能障害が見られるように、シナプスレベルでの分子変化の注意深い解剖は、これらの障害の分子メカニズムの探求に役立ちます。
