שיטת הזיהוי וסכמת הצבעים של ציטומטריה זרימה של TPFS ספציפי לנגיף דלקת המוח היפנית נבדקו כדי לספק סימוכין למחקרים דומים. הדגמת ההליך תבוצע על ידי לינלין ז'אנג ומנג ג'אנג, שני סטודנטים מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, לעורר את PBMCs של קבוצת גירוי JEV עם חלקיקי JEV מומתים מרוכזים במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות נוגדנים חד שבטיים, CD28 ו- CD49d, CD107a, GolgiPlug, ו monensin.
לאחר מכן, לעורר את PBMCs של קבוצת הביקורת ללא חלקיקי וירוס מרוכזים במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות נוגדנים חד שבטיים, CD28 ו CD49d, CD 107a, GolgiPlug ו monensin. לאסוף את ההשעיה התא מכל קבוצה בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
השהה את התאים ב 1 מיליליטר של PBS. הוסיפו צבע הניתן לתיקון לתרחיף התאים ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה ב 500 גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ולהסיר את supernatant.
לאחר החייאת התאים במיליליטר אחד של PBS, שוב, צנטריפוגה ב 500 גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant כפי שהוכח קודם לכן. כדי לבצע צביעת סמן פני התא, יש לתלות את התאים ב-100 מיקרוליטרים של PBS, ולהוסיף שני מיקרוליטרים של כל נוגדן סמן פני השטח לתרחיף התאים בכל צינור. יש לדגור על הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך הגנה עליהם מפני אור.
צנטריפוגה ב 500 גרם במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant כפי שהוכח בעבר. שוב, להשעות את התאים במיליליטר אחד של PBS. יש להשתמש בצנטריפוגה במשקל 500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את הסופר-נטנט בזהירות.
כדי לבצע קיבוע ושבירת ממברנה, יש לתלות מחדש את התאים עם 500 מיקרוליטרים של תמיסה מקובעת שוברת ממברנה ולקבע את התאים למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. ואז צנטריפוגה ב 500 גרם במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant. לאחר החייאת התאים במיליליטר אחד של PBS, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 500 גרם בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant בזהירות, כפי שהוכח קודם לכן.
לאחר מכן, יש להשעות את התאים ב-100 מיקרוליטרים של PBS ולהוסיף שני מיקרוליטרים של כל נוגדן ציטוקינים לתרחיף התאים בכל צינור להכתמת ציטוקינים תוך-תאיים. לדגור על הצינורות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שוב, צנטריפוגה ב 500 גרם במשך חמש דקות, ולהסיר את supernatant כפי שהוכח קודם לכן.
שוב, להשעות את התאים במיליליטר אחד של PBS. יש להשתמש בצנטריפוגה במשקל 500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר בזהירות את הסופר-נטנט כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS כדי להשעות את התאים.
לאחר בידוד דגימת ה-PBMC בלבד, כפי שהוכח קודם לכן, חלקו את תרחיף התא ל-12 חלקים שווים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המתוארים בכתב היד. באופן דומה, לאחר הוספת סמני פני התא ונוגדן ציטוקינים תוך תאי, כפי שהוכח קודם לכן, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של PBS כדי להשהות את התאים והמערבולת במהירות נמוכה. באמצעות דגימה לא מוכתמת, התאימו את הפיזור הקדמי, את פיזור הצד ואת מתחי הצבע הפלואורסצנטיים השונים, תוך התאמת פיצוי הציטומטריה של הזרימה כדי לחסל את אותות הזיהום בין הפלואורופורים השונים, תוך שימוש בדגימות הצביעה הבודדות.
צייר שער מצולע דרך אזור הפיזור הקדמי, אזור הפיזור הצדדי מתווה נקודה כדי לבחור את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה, תוך אי הכללת הפסולת, ושער מלבני דרך אזור הפיזור הקדמי, תרשים נקודה ברוחב פיזור קדימה כדי לבחור את התאים הבודדים. לאחר מכן, צייר שער מלבני דרך חלקת הנקודה של אזור הפיזור החי והמת כדי לבחור את התאים החיים, ושער מלבני דרך תרשים הנקודה של אזור הפיזור הצדדי CD3 כדי לזהות את שלושת תאי ה-T החיוביים של התקליטור. לאחר מכן, צייר שער מרובע דרך עלילת הנקודה CD4, CD8 כדי לזהות את תאי ה- T החיוביים של CD4 או CD8 ודרך עלילת הנקודה CD45RO, CD27 כדי לחלק את תאי ה- T החיוביים של CD4 או CD8 ל- TCM ו- TEM.
לאחר ציור השערים של CD107a, אינטרפרון גמא, גורם נמק הגידול אלפא, אינטרלוקין 2 וחלבון דלקתי מיקרופג אחד אלפא מ TCM או TEM של CD8 חיובי או CD4 חיובי תאי T כדי לקבוע את התדירות של דפוסי תגובה שונים בהתאמה. העמיסו את הדגימות על הציטומטריה ברצף. אסטרטגיית ה-gating הופעלה כדי לזהות את ה-TCM או ה-TEM של תאי T חיוביים מסוג CD8 או CD4 ואת תת-הקבוצות שלהם באמצעות רוחב אזור הפיזור קדימה, ולאחר מכן התוויית הנקודה של אזור הפיזור הצדדי.
האפיון הפולי-פונקציונלי של תגובות תאי T חיוביות ל-CD4 ו-CD8 ל-JEV הצביע על כך שרמות מוגברות של CD107a, אינטרפרון גמא, גורם נמק גידולי אלפא ואינטרלוקין 2 זוהו בתאי TCM חיוביים ל-CD8 של הילדים המחוסנים לאחר גירוי JEV בהשוואה לאלה של ילדים לא מחוסנים. עם זאת, רמת החלבון הדלקתי מקרופאגים אלפא אחד לא הייתה שונה בין שתי הקבוצות. רמות גבוהות יותר של CD107a, ואינטרפרון גמא זוהו בתאי ה-TEM החיוביים ל-CD8 של הקבוצה המחוסנת תחת גירוי JEV בהשוואה לקבוצה הלא מחוסנת.
בעוד שגורם נמק הגידול אלפא, אינטרלוקין 2 וחלבון דלקתי מקרופאגים אלפא אחד, לא היו גבוהים באופן משמעותי בתאים חיוביים אלה. האנטיגן JEV גרם בהצלחה לרמות גבוהות יותר של CD107a, אינטרפרון גמא, גורם נמק גידולי אלפא, וחלבון דלקתי מקרופאגים אלפא אחד בתאי TCM חיוביים CD4 של הקבוצה המחוסנת בהשוואה לקבוצה הלא מחוסנת. עם זאת, שיעור התאים החיוביים של אינטרלוקין 2 לא היה שונה בין שתי הקבוצות תחת גירוי JEV.
חלקם של CD107a חיובי, אינטרפרון גמא חיובי ותת-קבוצות אלפא חיוביות של גורם נמק גידולי, תאי TEM חיוביים תת-CD4 בקבוצה המחוסנת היה גבוה יותר בנוכחות JEV, מאשר בקבוצה הלא מחוסנת. האימונוגניות של תאי ה-T של הגירויים ואסטרטגיות התאמת הצבעים התואמות הן שלבים קריטיים בפרוטוקול זה.
