פרוטוקול PLA שלנו מאפשר לזהות ולכמת אינטראקציה אנדוגנית בין חלבונים באתרי מגע עם ממברנה. השתמשנו בו כדי לחקור את האינטראקציה בין שני חלבוני רשתית אנדופלסמית באתרי מגע מיטוכונדריאליים ברשתית אנדופלסמית. טכניקה זו משלבת PLA עם צביעת אברונים וניתוח מרחקי אברונים.
הוא מאפשר למקם ולכמת באינטראקציה בין חלבונים באתרי מגע בין אברונים. לאחר ביצוע בדיקת קשירת קרבה, או PLA, ורכישת תמונה, הגדר את תוכנת ניתוח התאים להפעיל את MATLAB ולהפעיל הרחבה על ידי לחיצה על האפשרות Imaris במערכת ההפעלה Mac או תפריט עריכה ב- Windows. בחרו בהעדפות, שנו לחלונית 'כלים מותאמים אישית' וקבעו את הנתיב.
כדי לייבא את התמונות לתוכנה, המירו את תמונות המחסנית הקונפוקלית לקובץ IMS, ישירות דרך אזור הזירה או באמצעות ממיר הקבצים העצמאי המאפשר המרת אצווה. לאחר הייבוא, לחץ על עריכה, עבור אל מאפייני תמונה ובחר גיאומטריה של התמונה כדי לבדוק את כיול התמונה. בדקו שגודל הווקסל תואם לגודל הפיקסלים הצפוי לתמונה בפועל ב-X וב-Y, ואת השלב שמיישם המיקרוסקופ ליצירת ערימת Z ב-Z.To התאמת הניגודיות של הערוצים השונים לחצו על 'עריכה' בתפריט, עברו לכוונון התצוגה ובחרו 'הצג התאמת תצוגה'.
התאימו כל ערוץ בנפרד כדי למטב את התצוגה של כל צבע. שלב זה חיוני כדי להגדיר ספים מדויקים או לזהות אובייקטים חלשים. לאחר מכן, לחץ על ערוך ובחר חתוך תלת-ממד כדי להגביל את הניתוח לתא בודד על-ידי חיתוך התמונה.
כדי לנתח תא אחר באותו שדה ראייה, פתח שוב את אותה תמונה וחתוך אותה באופן שונה. זהה את אותות ה- PLA הנוצרים במיקום האינטראקציה של ORP5 ו- ORP8 על ידי לחיצה על האפשרות הוסף נקודות חדשות, אשר יוצרת קבוצה חדשה של אובייקטים ופותחת את אשף זיהוי הנקודות. בחרו בערוץ שבו יש לבצע את זיהוי הספוט.
התאם את קוטר XY המשוער כדי לסייע לאלגוריתם זיהוי הכתמים למצוא את האובייקטים המעניינים. אם הערך שנבחר גבוה מדי, האובייקטים הסמוכים יתמזגו, ואם הערך קטן מדי, אותות חריגים עשויים להתגלות. כעת, לחץ על חיסור רקע כדי להסיר את רקע התמונה לפני זיהוי הספוט כדי לשפר את הניגודיות המקומית סביב האובייקטים המעניינים.
התאם את סף זיהוי הכתמים על-ידי שמירה על האיכות כפרמטר הסף בסף האוטומטי של התוכנה, או שנה מעט ערך זה כדי לזהות את כל האובייקטים. לאחר סיום זיהוי הספוט, שמרו את פרמטרי הזיהוי והשתמשו בהם שוב לעיבוד תמונות אחרות. לאחר מכן, זהה את הרשת המיטוכונדריאלית כדי ליצור עיבוד משטח על ידי לחיצה על הוסף משטחים חדשים כדי ליצור אובייקט חדש ופתח את אשף זיהוי המשטחים.
בחרו בערוץ שבו יש לבצע את יצירת המשטח. החילו את מסנן גאוס לקבלת משטח חלק יותר בלחיצה על תיבת הסימון 'חלק' וקבעו סף המציין את הפרטים הקטנים שניתן לראות על פני השטח. לאחר מכן, בצע חיסור רקע כדי לשפר את הניגודים המקומיים ולהתאים את הסף כדי לזהות את הרשת המיטוכונדריאלית בהתבסס על עוצמת האות.
החילו מסנן על המשטח כדי להסיר שאריות קטנות מהסף על-ידי בחירת מספר מסנן הווקסלים בחלון המשטח המסווג, ושחקו עם הסף העליון והתחתון כדי לשמור רק על מושאי העניין. לאחר סיום יצירת המשטח, שמרו את פרמטרי היצירה והשתמשו בהם שוב לעיבוד תמונות אחרות. ליצירת מפת מרחק מחוץ למשטח המיטוכונדריה שנוצר, בחרו במשטח המיטוכונדריה בתיבת עץ הסצנה.
לחצו על עיבוד תמונה ובחרו פונקציה 'משטחים', ולאחר מכן על שינוי המרחק. תוסף MATLAB המבקש מהמשתמש לבחור אם המפה צריכה להיות מחושבת מחוץ או בתוך משטח האובייקט יופיע. בחר עצם משטח חיצוני כדי למדוד את המרחק בין כתמי PLA לבין פני השטח של המיטוכונדריה.
לאחר יצירת המפה, היא מופיעה כערוץ חדש בחלונית התאמת התצוגה. בערוץ זה, לכל פיקסל יש ערך המתאים למרחק למיטוכונדריה הקרובה ביותר. בחרו את הנקודות שנוצרו בעבר בתיבת עץ הסצנה כדי למדוד את המרחק מכל נקודה למיטוכונדריה הקרובה ביותר, וזהו והמחישו את הנקודות הקרובות ביותר.
כעת, בחרו ערכים ספציפיים ועוצמת מרכז של הערוץ המתאימים למפת המרחק בסטטיסטיקה וביומן מפורט כדי למדוד את הערך של כל מרכז נקודתי, המתאים למרחק שלו למיטוכונדריה הקרובה ביותר במפת המרחק. ייצא את הנתונים כקובץ CSV על ידי לחיצה על סמל התקליטון בפינה השמאלית התחתונה של החלון. כדי לחלץ תת-אוכלוסייה של כתמים בהתבסס על מרחקיהם למיטוכונדריה, בחרו את הכתמים בעץ הסצנה ולחצו על לשונית המסננים.
הוסף מסנן חדש המבוסס על עוצמת המרכז של הערוץ המתאים למפת המרחק בחלון זה, וחלץ את הכתמים במרחק של פחות מ- 380 ננומטר מהמיטוכונדריה על ידי הגדרת הסף התחתון לאפס מיקרומטר והסף העליון ל- 0.380 מיקרומטר. בצעו שלב שכפול בלחיצה על הלחצן 'שכפל בחירה לנקודות חדשות' כדי להתמקד בנקודות שנבחרו. תמונות קונפוקליות של ORP5-ORP8 PLA אנדוגני הראו אינטראקציות בתאי HeLa בתת-הדומיינים הרשתית, ER קליפת המוח ו-ER במגע הדוק עם מיטוכונדריה, המכונים בדרך כלל ממברנות ER הקשורות למיטוכונדריה.
ניתוח הדמיה תלת-ממדית גילה כי כ-50% מהאינטראקציות האנדוגניות ORP5-ORP8 PLA זוהו בקרומי מיון הקשורים למיטוכונדריה. אחוז אינטראקציות ORP5-ORP8 PLA שהתרחשו בקרומי מיון הקשורים למיטוכונדריה בתאים עם ביטוי יתר ORP5 ו-ORP8 היה דומה לזה שנצפה בתאים שבהם חלבונים אלה באו לידי ביטוי ברמות אנדוגניות. הפחתת הרגולציה של ORP5 ו-ORP8 גרמה לירידה מסיבית במספר הכולל של אותות PLA, בעוד שביטוי היתר שלהם הגדיל את ה-PLA.
אותות PLA זוהו בזוגות ORP5-PTPIP51 ו- ORP8-PTPIP51, והמספרים הממוצעים שלהם היו דומים לזוג ORP5-ORP8 PLA, ואישרו לוקליזציה של ORP5 ו- ORP8 באתרי מגע עם קרום ER-מיטוכונדריה. יתר על כן, האינטראקציה של ORP5-ORP8 PLA במגעים של קרום פלזמה ER באתר מגע משולש בין מיטוכונדריה, חדר מיון וטיפות שומנים מזוהים באמצעות תאי HeLa נגועים PHPLCD-RFP או mCherry-PLN1. כמו בכל שיטת ניתוח תמונה, איכות התמונה היא נקודת מפתח, ולכן אופטימיזציה של האות הוא מכריע עבור זיהוי אוטומטי של האובייקטים.
טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את הקשרים בין שני אברונים תאיים או מרובים, כפי שעשינו במחקר האחרון שלנו על תפקוד ORP5 ו- ORP8 בשלושה צדדים ER, מיטוכונדריה וטיפות שומנים אתרי מגע. טכניקה זו יכולה להיות מועילה במחקרים אחרים בתחום התקשורת התוך-תאית כדי לזהות קשרים בין-אברונים רב-משתתפים חדשים.
