וידאו זה מדגים את הייצור והיישום של פרוסות כבד לחתוך מדויק כמו מודל ניסיוני אקס ויוו של ביולוגיה רקמת הכבד. פרוסות כבד מדויקות תופסות נישה ניסיונית הקיימת בין מחקרים בבעלי חיים ב-vivo לבין שיטות לתרבות תאי במבחנה. טכניקה זו יש מספר יתרונות מרכזיים על in vivo מחקרים שנעשו בבעלי חיים, כולל היכולת להשתמש בדגימות שליטה וטיפול מאותו כבד, בידוד של רקמת הכבד כדי להסיר השפעות מחוץ ליעד מערכות איברים אחרות, ואת היכולת להשתמש reagents שעשויה להיות השפעה שלילית אם מוחל על עכבר חי שלם, למשל, מעכבי מסלול רעיל.
הטכניקה כוללת שימוש בלהב רוטט רוחבי כדי לחתוך פרוסות כבד דקות במיוחד של רקמת כבד בת קיימא ואחריו תרבות רקמת מעבדה. התנודות של הלהב מונע קריעה הנגרמת על ידי מתח גזים. בדוגמה זו, אנו נראה את הטכניקות להכנת פרוסות כבד ex vivo קיימא, ולהדגים את התועלת של תרבות פרוסת הכבד בניסויים לדוגמה שבו רקמת אקס ויוו זו מטופלת בחומצות מרה כדי לעורר פגיעה בכבד cholestatic כדי להעריך את המנגנונים של fibrogenesis הכבד.
הכנס את הלהב לזרוע החיתוך. לחטא את הלהב ואת זרוע החיתוך עם תותבת אתנול 70%. תמיד להיזהר כדי למנוע מגע עם הלהב.
יש לחטא את מגש החיץ בתתבת אתנול של 70%, ולנגב עם רקמה סטרילית. הכנס את מגש החיץ לתוך הרטט והדק את בורג ההרכבה. הגדר את זרוע החיתוך לגובה המרבי הזמין.
תבדוק את זווית הלהב. על הרטט שלנו, אנו משתמשים בזווית של 10 מעלות מאופקי, עם הלהב משופע כלפי מטה לכיוון המדגם. ודא שזווית הלהב קבועה היטב.
לחטא את מחזיק הדגימה, שוב, עם פתרון אתנול 70%. חבר את מי הקירור עבור מצנן תרמואלקטרי Peltier, הממוקם מתחת למגש החיץ. דגמי ויבריום מסוימים משתמשים באמבט קרח לקירור במקום זאת.
תתקן את צינור המים לניקוז, ותדליק את המים. הגדר את הצידנית לארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו למגש החיץ קרבס-הנסלייט קר כקרח.
כל המכשירים הכירורגיים וחומרים צריכים להיות סטריליים. עכברים צריכים להיות מאוד הרדמה או המתת לחץ. משטחי עור על העכברים נוהו על ידי הרטבה עם תותב אתנול 70%.
בצע חתך קו האמצע לתוך העור מבסיס חלל הבטן לסרעפת. באמצעות מטסות ומספריים נקיים, פתח את חלל הבטן. הסר את הכבד במהירות, מבלי לפגוע באונות.
לדחוף את הכבד כלפי מטה, לחתוך את רקמת החיבור בחלק העליון של הכבד. דחוף את הכבד כלפי מעלה. החזק את אזור כלי הדם המרכזי של הכבד עם המדפים ולמשוך כלפי מעלה.
חותכים את כלי הדם של רקמת החיבור. יש לדאוג לא לפגוע האונות הכבד, וגם, לדאוג לא לחתוך לתוך מערכת העיכול. מניחים את הכבד שהוסר לתוך צלחת סטרילית של חיץ קרבס-Henseleit קר כקרח.
הפרד את הכבד לאונות בודדות. בחר אונה אחת בכבד והצב צד שטוח על צלחת סטרילית חדשה. שמור אונות אחרות על קרח במאגר קרבס-Henseleit.
לקצץ את הקצוות של האונות הכבד. גיזום חשוב, במיוחד בקצה שיגע תחילה בלהב החיתוך, כיוון שעצם הרקמה ניצב יחסית ללהב החיתוך ימנע דחיסת רקמות שיכולה להתרחש בזוויות רדודות. חיתוך הרקמה סביב שלושת הקצוות האחרים מסיר חלק גדול מהכמוסות הסיביות בקצה הרקמה, ובדרך כלל מאפשר הסרה קלה יותר של פרוסות הרקמה.
מניחים שכבה דקה של דבק cyanoacrylate על הקצה הקדמי של מחזיק הדגימה, מעט גדול יותר מאשר אונות כבד קצוצות. הסר כל שאריות של חיץ מן הרקמה באמצעות חומר סופג סטרילי. מניחים את האונה הכבד על דבק cyanoacrylate, עם הקצה הגדול ביותר פונה לכיוון החזית.
אפשר לרפא באוויר במשך 1 עד 2 דקות. מניחים את הרקמה המחוברת למחזיק הדגימה לתוך הרטט. הגדר את מהירות הרטט.
מנמיך את להב החיתוך עד שהוא ממוקם ממש מעל האונה הכבדית. הפעל את זרוע החיתוך הרוטטת מעל הדגימה. רטט של הלהב במכונה זו מופעל על ידי דוושת הרגל.
מחזירים את הלהב לאחור ומנמיכים את גובה הלהב ב-250 מיקרומטר. חזור על תהליך זה עד השכבה העליונה של הרקמה מוסרת. השליכו את הפרוסה הראשונה או שתיים, גם אלה יכילו את הקפסולה של גליסון, ולכן לא יכילו הרבה רקמת כבד תפקודית.
כדי לחתוך פרוסות כבד, לאט לאט לקדם את הלהב רוטט לתוך הרקמה על ידי הפיכת הידית. השתמשו במברשת צבע קטנה כדי להנחות בעדינות את הרקמה במהלך תהליך החיתוך. השתמש במברשת הצבע כדי לאסוף את קטע הרקמה החתוכה, ולאחר מכן למקם את קטע הרקמה לתוך צינור סטרילי המכיל מאגר קרבס-Henseleit לאחסון.
כאשר לא בשימוש, לשמור את הצינור הזה על קרח. חלק מהזמן, הרקמה עושה לקרוע במהלך תהליך החיתוך, אבל ברוב המטרות, הרקמה היא עדיין שמיש. חותכים את פרוסות הרקמה עד ליד דבק cyanoacrylate.
אל תחתוך את הדבק. חזור על הפעולה עם אונות הכבד האחרות, אשר יושבים על קרח, עד המספר הנדרש של פרוסות רקמה מתקבל. כדי לנקות את מחזיק הדגימה, או להשתמש בלהב כדי לגרד את תערובת רקמת הדבק, או את התערובת ניתן לרכך באמצעות ממיסים כגון אצטון או דימתיל סולפוקסיד.
במכסה המנוע של תרבות הרקמות, פיפטה מ"ל אחד של מדיום וויליאמס'ה המכיל 10% סרום חזיר עוברי ואנטי מיקרוביאלים לצלחת של 12 בארות. הסר את פרוסות הרקמה על ידי מערבולת בעדינות את התערובת וטיפ לתוך צלחת סטרילית. חותכים את הרקמה לגודל אחיד בערך.
בדוגמה זו, כיוונו לפרוסות רקמה עם שטח פנים סביב 50 מילימטרים מרובע. יש לדאוג לבחון את פרוסות הרקמה לעקביות. פרוסות כהות יותר מצביעות על כך עובי הרקמה גדל, ויש להשליך אותו.
פרוסות קלות יותר מצביעות על נוכחות של דבק ציאנואקרילאט שנרפא, ויש להשליך אותן. מעבירים את פרוסות הרקמה לצלחת 12 באר המכילה מיליליטר אחד של מדיה. הדגירה פרוסות הכבד בתנאים נורמליים של תרבות הרקמות.
במידת האפשר, השתמש בשיטות כדי לשפר את זמינות החמצן לפרוסות הרקמה. ביום שאחרי, לשנות את המדיה באמצעות פיפטה ידנית כדי למנוע אובדן של רקמות על ידי יניקה. פרוסות הכבד המדויקות מוכנות כעת לשימוש ניסיוני.
עבור היישום שלנו, טיפלנו פרוסות הכבד עם חומצות מרה במשך יומיים, הומוגנית במאגר תמוגה עבור חילוץ RNA שליח וניתוח qPCR. כדי לבחון את הכדאיות של פרוסות כבד מדויקות לאורך זמן, השתמשנו ברמות ATP כ- Proxy לכדאיות התא. רמות ה-ATP היו מנורמלות לחלבון, ונמדדו בנקודות זמן מרובות לאחר הבידוד.
רמות ATP ירדו בדגימות המיידיות ושעה אחת, אולם זה התאושש בשלוש שעות. בעקבות זאת, רמות ה-ATP נשמרו במשך חמישה ימים, אם כי הם במגמת ירידה לאורך זמן. כתמי H&E שימשו לבחינת פרוסות כבד מדויקות ש נשמרו בתרבות עד חמישה ימים.
מורפולוגיה של רקמות מרמזת על נמק שהתרחש ביום השני, עם נמק חמור שמתרחש ביום החמישי. בגלל הנמק שקורה בין ימים יומיים לחמישה, אנו ממליצים שהתועלת הניסיונית של טכניקה זו מוגבלת לשלושה ימים. עם זאת, זה יכול להיות משופרת באמצעות טכניקות אספקת חמצן טוב יותר לפרוסות הרקמה.
פרוסות כבד בחיתוך מדויק נראה גם יש עיבוי של סיבי קולגן יחסית לזמן בתרבות. זה מרמז על תהליכים פיברוגניים ספונטניים המתרחשים. בניסוי לדוגמה, פרוסות הכבד בחיתוך מדויק טופלו בשלוש חומצות מרה נפרדות במשך יומיים, כדי לחקות cholestasis הכבד.
כאשר מסתכלים על ביטוי mRNA של שלושה גנים ספציפיים cholangiocyte, שתי חומצות מרה מצומד, חומצות גליכוכולית ו taurocholic, גדל באופן משמעותי את הביטוי של שני cytokeratin-19 ו connexin-43. זה עולה בקנה אחד עם התפתחות cholangiocyte. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור פרוסות כבד לחתוך מדויק, וכיצד לבצע תרבות רקמות בסיסית.
פרוסות כבד מדויקות יכולות לשמש למגוון רחב מאוד של יישומים, כולל חקירות ניסיוניות בביטוי RNA, ביטוי חלבון, אפיגנטיקה, איגוד DNA, חילוף חומרים, מנגנוני זיהום, פלישה לסרטן, פרמקולוגיה, ביולוגיה של התא, מחקרי הפרשה, רק שם כמה.
