השיטה שלנו מאפשרת חקירות תת-תאיות מכניסטיות בתחום המהיר של מכנוביולוגיה על ידי קיבוע שינויים זמניים בחלבונים במקום ולאחר מכן זיהויים עם נוגדנים ספציפיים. שיטה זו קלה מבחינה טכנית ליישום. התוצאות תקפות מאוד וניתנות לשחזור.
כמו כן, בהשוואה לטכניקות אחרות, השיטה שלנו יכולה באמת לשמש ביעילות בתחום המתפתח של איתות תאי דם אדומים לאחר תרגום, אשר תלוי בשינויים חלבונים זמניים, במיוחד mechanosignaling תאים אדומים. כדי לבצע קיבוע חלבון RBC, יש לדלל דם שלם ביחס של אחד עד שניים בתמיסת פרפורמאלדהיד 4% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגות את תמיסת הדם ב 132 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את supernatant.
השהה מחדש את גלולת RBC בשני נפחים של PBS טוחנת 0.1, ודגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שוב, צנטריפוגו את הדגימה, והסירו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את גלולת RBC בנפח אחד של PBS טוחנת 0.1. תייגו שקופית במיקרוסקופ עם מזהה הדגימה והנוגדן שהוחל באמצעות עט עמיד לאלכוהול.
הוסף 10 מיקרוליטר של פתרון RBC מוכן. מקם שקופית שנייה על הדגימה בזווית של 45 מעלות ומפזר את הדגימה באופן שווה לאורך השקופית. תקן בחום את המגלשה על ידי ריחוף הדגימה מעל מבער Bunsen בתנועה קבועה למשך חמש עד שבע שניות.
עבור צביעה אימונוהיסטוכימית, סמן את אזור 2/3 של השקופית כבדיקה ו 1/3 כבקרה באמצעות עיפרון שומן. לאחר מכן שטפו את אזורי הדגימה פעמיים על ידי מריחת TBS למשך 30 שניות. לאחר השטיפה השנייה, מוסיפים 0.1% טריפסין, ומכסים את המגלשה באמצעות תא דגירה ייעודי עם מכסה.
לדגור את הדגימה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מלאו במי ברז ועצרו את תגובת האנזים על ידי הוספת מי הברז מהכוס למגלשה. שפכו את התמיסה ושטפו את שני האזורים שלוש פעמים עם TBS.
לאחר השטיפה הסופית, מוסיפים תמיסת חסימת פרוקסידז, ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שפכו את התמיסה ושטפו את שני האזורים שלוש פעמים עם TBS. לאחר מכן מוסיפים תמיסת חלב רזה 3% ודגרים במשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, יוצקים את התמיסה, ומוסיפים את תמיסת הנוגדנים הראשונית לאזור הבדיקה. הוסף פתרון בקרת נוגדנים לאזור הבקרה. לדגור על הדגימות בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה.
למחרת, שפכו את תמיסת הנוגדנים ושטפו את שני האזורים שלוש פעמים עם TBS. לאחר מכן הוסיפו תמיסת סרום עיזים רגילה 3% כדי למנוע קשירה לא ספציפית ודגרו במשך 30 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים תמיסת נוגדנים משנית ודגרים במשך 30 דקות.
יוצקים את תמיסת הנוגדנים ושוטפים את האזורים שלוש פעמים עם TBS לפני שממשיכים בפיתוח הכתמים. לאחר מכן, כדי לבצע תגובת פרוקסידז חזרת מצומדת אבידין, להוסיף תמיסת avidin peroxidase מדולל לדגור במשך 30 דקות. הניחו את המגלשה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 200, והוסיפו תמיסת DAB טרייה לשני האזורים.
עקוב אחר הצביעה של RBCs ברציפות, ועצור את הצביעה על ידי הסרת תמיסת DAB עם פיפטה חד פעמית לפני שהרקע מתחיל לצבוע. כדי לבצע התייבשות דגימה, הניחו את המגלשה במדף זכוכית וטבלו במשך חמש שניות כל אחת בריכוז אתנול עולה, ולבסוף בקסילול. לאחר התייבשות, הניחו את השקופית על נייר טישו עם RBCs בחלק העליון כדי לספוג נוזלים עודפים.
הוסף שתיים, או שלוש טיפות של אמצעי הרכבה על חלקת כיסוי וכסה את השקופית באמצעות החלקת הכיסוי. לצורך הדמיה והדמיה, מקם את השקופית במיקרוסקופ אור משודר יחד עם מצלמה. הפעל את מקור האור והמצלמה והפעל את התוכנה.
במצב שדה בהיר, מקד את ה- RBCs על-ידי סיבוב ידיות כוונון המיקוד הגסות והעדינות. באופן דומה, מקד את RBCs במצב פלואורסצנטי. לניתוח ערך אפור של RBC, סמן את הקצה של כל RBC באמצעות כלי הבחירה הסגלגל בתוכנת ImageJ.
באמצעות הפקודה מדידה, מדוד את הערכים האפורים של 50 RBCs מהבדיקה ו- 10 RBCs מהפקד. עבור צביעה immunofluorescent של חלבונים RBC, לדגור את הדגימה עם נוגדן פלואורסצנטי משני מצומד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, להגן עליו מפני אור. לאחר הדגירה, יוצקים את תמיסת הנוגדנים ושוטפים את המגלשה שלוש פעמים עם TBS.
השאירו את ה-TBS על הדגימה לאחר השטיפה הסופית. יש לייבש את הדגימה ולהכין את השקופית עם פתק כיסוי להערכה מיקרוסקופית כפי שהודגם . הפעל את המיקרוסקופ ואת מקור האור הפלואורסצנטי, ומקד את RBCs במצב שדה בהיר.
צלם תמונות בעלות שדה בהיר ותמונות פלואורסצנטיות בשלושה אזורים נפרדים לפחות באזור הבדיקה של השקופית שנבחרה באופן אקראי. הגדר את זמן החשיפה לשנייה אחת לתמונות פלואורסצנטיות וצלם תמונה. לאחר מכן עברו למצב שדה בהיר, הגדירו את זמן החשיפה לאוטומטי וצלמו את תמונת השדה הבהיר המתאימה.
שמור את התמונות בתבנית TIFF. צלם תמונות פלורסנט ושדה בהיר בשני אזורים נפרדים שנבחרו באופן אקראי לפחות באזור הבקרה של השקופית. שמרו את התמונות בתבנית TIFF כדי לשמור על ערכי האפור המקוריים של פיקסלים, למנוע דחיסה ולשאת מטא-נתונים של הרכישה.
למדידת הערכים האפורים של RBCs שנלכדו, פתחו את ImageJ. סמן כל תא בעזרת הכלי בחירה אליפסה ונתח באמצעות הפקודה מדידה. סמן בין שלושה לחמישה אזורים ללא RBC וקבע את הערכים האפורים כדי למדוד את אות הרקע.
לביצוע ניתוח נתונים חלופי של תמונות שנלכדו, צרו פקודת מאקרו במהדורת פיג'י של ImageJ לבחירה אוטומטית, תיקון רקע וניתוח ערך אפור של תמונה נתונה. פתח את תמונת תבנית TIFF לניתוח בפיג'י. לאחר מכן פתח את פלואורסצנטיות RBC.
ijm מאקרו ולחץ על הפעל. האות של נוגדנים הממוקדים כנגד RBC תחמוצת החנקן סינתאז, או NOS, פוספורילציה בשאריות סרין 1177 במנוחה ובתגובה לחשיפה לכוח מכני הוערך באמצעות אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה. עלייה של פי שלושה בסיגנל של נוגדנים הממוקדים נגד RBC-NOS פוספורילציה בשאריות סרין 1177 זוהתה בתגובה לחשיפה לכוח מכני של RBCs בהשוואה לתאים הלא גזורים בהתאמה כאשר הוערכו בשיטה האימונוהיסטוכימית, או האימונופלואורסצנטית.
המשתמש צריך לוודא כי הנוגדן מוחל רק על אזור הבדיקה. אחרת, לא ניתן לנתח את הדגימה, עקב פקד חסר. בהינתן זמינותם של מגוון רחב של נוגדנים, התמקדות בחלבונים רבים ושונים ובתהליכי איתות אפשרית בשיטה זו.
