Dieses Protokoll beschreibt die Methode der Ultrastrukturexpansionsmikroskopie in drei in vitro Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger, der für die Chagas-Krankheit verantwortlich ist. Dieses Protokoll bietet eine Alternative zu den aktuellen hochauflösenden Bildgebungs- und Elektronenmikroskopietechniken, mit dem Vorteil, dass es mit herkömmlichen Mikroskopen kompatibel ist, die in den meisten Biologielabors und in Maschinenkernanlagen zu finden sind. Es verwendet gängige Techniken, die für die meisten Forschungslabore üblich sind, um Bilder zu erhalten, die eine dreidimensionale Rekonstruktion ermöglichen.
Das Protokoll erleichtert die Untersuchung nanoskaliger Strukturen in Trypanosomatiden, ermöglicht die Inspektion einer Zellpopulation und die Abbildung des gesamten Volumens einer interessierenden Zelle mit hoher Auflösung. Es ist besonders nützlich für wissenschaftsspezifische Zelltypen in transienten Phasen des Zellzyklus und der Differenzierung. Um noch mehr Auflösung zu erreichen, werden wir die Kombination von ExM mit hochauflösenden mikroskopischen Techniken nutzen, um Auflösungen unter 20 Nanometern zu erreichen.
Beginnen Sie mit der Zubereitung von Trypanosoma cruzi epimastigote Suspension aus einer logarithmischen Phasenkultur in LIT-Medium, das mit 10 % FCS ergänzt wurde. Die Suspension wird bei 5.000 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Waschen Sie das Pellet zweimal mit PBS und resuspendieren Sie es dann in 200 Mikrolitern PBS.
Kleben Sie die Suspension auf einen runden, 12 Millimeter dicken, mit Poly-D-Lysin beschichteten Deckglas und inkubieren Sie es 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie eine Vernetzung verhindern. Entnehmen Sie den Überstand einer Vero-Zell-Monoschicht, die mit den Trypomastigoten infiziert ist, vier Tage nach der Infektion. Bestimmen Sie mit einer Neubauer-Zellzählkammer die Konzentration der Trypomastigoten.
Die Zellsuspension wird bei 7.000 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Spülen und Resuspendieren der Zellen in PBS überführen Sie die Zellsuspension auf einen mit Lysin beschichteten Deckglas und inkubieren Sie den Deckglas 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Vernetzung verhindern. Um Amastigoten aus infizierten Vero-Zellen zu gewinnen, legen Sie einen sterilen 12 Millimeter dicken runden Deckglas auf den Boden einer 24-Well-Gewebekulturplatte.
Bereiten Sie als Nächstes eine Suspension von Vero-Zellen in DMEM vor, die mit 2 % FCS ergänzt ist, und säen Sie 500 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte über Nacht, um die Zelladhäsion sicherzustellen. Waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 500 Mikrolitern sterilem PBS.
Geben Sie T.cruzi trypomastigotes in die Zellen und inkubieren Sie wie zuvor sechs Stunden lang. Beginnen Sie mit der Zugabe von 0,5 Millilitern Vernetzungspräventionslösung zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte. Tauchen Sie dann die 12 Millimeter dicken, mit Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläser mit anhaftenden Parasiten ein.
Nachdem Sie die leeren Vertiefungen mit Wasser gefüllt haben, um die Verdunstung zu reduzieren, verschließen Sie die Platte mit einer Siegelfolie und inkubieren Sie. Um die Proben zu gelieren, bauen Sie zunächst eine feuchte Kammer in einer Petrischale zusammen, indem Sie eine Dichtungsfolie auf Seidenpapier legen. Befeuchten Sie dann das Seidenpapier mit Wasser und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius, um es abzukühlen.
Legen Sie die kühle, feuchte Kammer auf Eis. Anschließend aspirieren Sie mit einer Drei-Milliliter-Pasteurpipette die Vernetzungspräventionslösung aus den Vertiefungen der 24-Well-Platte. Entfernen Sie nun mit einer Pinzette die Deckgläser und legen Sie sie mit den Parasiten nach oben auf das Seidenpapier.
Nehmen Sie 90 Mikroliter monomere Lösung in ein Röhrchen und fügen Sie jeweils fünf Mikroliter aufgetautes TEMED und APS hinzu. Wirbeln Sie die Mischung zwei bis drei Sekunden lang ein. Pipettieren Sie 35 Mikroliter dieser Mischung über die Siegelfolie für jeden Deckglas und legen Sie die Deckgläser sofort mit einer Pinzette mit den Parasiten nach unten über den Tropfen.
Inkubieren Sie die Feuchtkammer fünf Minuten lang auf Eis, dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Beginnen Sie damit, zwei Milliliter Denaturierungslösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu pipettieren. Die gelierten Deckgläser, die die Trypanosoma cruzi-Parasiten enthalten, in die Denaturierungslösung geben und unter leichtem Rühren inkubieren.
Zur Förderung der Gelablösung. Übertragen Sie das Gel mit einem Metallspatel vorsichtig in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter der Denaturierungslösung enthält. Inkubieren Sie das Röhrchen mit einer gesicherten Kappe auf einem Heizblock.
Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Denaturierungslösung aus den Mikrozentrifugenröhrchen zu aspirieren. Übertragen Sie das Gel mit einem Metallspatel in eine Petrischale mit 10 Millilitern Reinstwasser und lassen Sie es 30 Minuten einwirken. Ersetzen Sie mit einer Einweg-Pasteurpipette von drei Millilitern das Reinstwasser in der Schale und lassen Sie das Gel über Nacht bei Raumtemperatur eintauchen.
Messen Sie am nächsten Tag den Geldurchmesser mit einem Messschieber, um die Ausdehnung zu berechnen. Die Proben waren als planares und durchscheinendes Gel sichtbar, das sich in Wasser um das 4- bis 4,5-fache ausdehnte. Beginnen Sie mit der Fluoreszenzmarkierung, indem Sie die expandierten Gelkreise, die die Parasiten enthalten, mit PBS waschen.
Schneide die Kreise in der Mitte mit einer Rasierklinge in 10 mal 10 Millimeter große Quadrate. Übertragen Sie nun jedes Quadrat auf eine 12-Well-Platte und inkubieren Sie es in 500 Mikrolitern des Primärantikörpers, verdünnt in 2 % PBS und BSA, unter Schütteln. Als nächstes inkubieren Sie die Gelquadrate in einer Sechs-Well-Platte, die zwei Milliliter PBS mit 0,1 % Polysorbat 20 enthält, 10 Minuten lang unter Schütteln.
Nach dem Transfer des Gels auf eine 12-Well-Platte fügen Sie 500 Mikroliter Sekundärantikörper in PBS mit DAPI und 10 Mikrogramm pro Milliliter NHS-Ester hinzu, der an das gewünschte Fluorophor konjugiert ist. Inkubieren Sie das Gel 2,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren. Nachdem Sie das Gel wie zuvor dreimal in PBS-Polysorbat 20 gewaschen haben, geben Sie das Gel in eine Petrischale mit Reinstwasser und inkubieren Sie es 30 Minuten lang.
Legen Sie ein 10 x 10 Millimeter großes Quadrat des expandierten Gelstücks auf eine 35 Millimeter große Bodenschale. Überprüfen Sie die Ausrichtung der Parasiten bei 10- oder 20-facher Vergrößerung. Bilden Sie die Proben in einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4 ab.
Erfassen Sie die Z-Stapel, die Breite jedes Z-Schritts und die empirisch ermittelte Belichtungszeit pro Pixel und erfassen Sie dann die Signalintensität und die Optimierung der Erfassungszeiten mit dem Scan-Zoom für eine effektive Vergrößerung, falls gewünscht. Öffnen Sie den Z-Stapel mit einer Bildverarbeitungssoftware und gruppieren Sie die gestapelten Bilder mit der Option "Z-Projekt gruppieren" für jeden Kanal. Wählen Sie dann die Projektion mit maximaler Intensität aus.
Führen Sie Bilder mit dem Werkzeug Kanäle zusammenführen zusammen. Wählen Sie die Farbe jedes Kanals aus und fügen Sie die Maßstabsleiste mit dem Werkzeug Maßstabsleiste in der Verarbeitungssoftware hinzu. Die primäre Expansion lieferte eine effektive Auflösung von 70 Nanometern, während die sekundäre Expansion Expansionsfaktoren von etwa 4,5 aufwies.
Die Färbung aller drei in vitro Lebenszyklusstadien von T.cruzi mit Zytoskelettmarkern zeigte die Lokalisation des Proteins im mikrotubulären Korsett und im flagellären Axonem. Die Chromatinkondensation wurde deutlich unterschieden, wenn sie mit DAPI gefärbt wurde. Die Immunlokalisation von Alpha-Tubulin-Markern, die sich mit der Pan-Proteom-Markierung bei Epimastigoten überlappte, zeigte, dass sich der mit Anti-Alpha-Tubulin und FITC gefärbte Basalkörper geteilt hatte.
Die Pan-Proteom-Markierung half dabei, verschiedene Parasitenstrukturen in allen Lebenszyklusstadien zu identifizieren.
