Bu protokol, Chagas hastalığından sorumlu patojen olan Trypanosoma cruzi'nin in vitro yaşam döngüsü aşamalarında ultrayapı genişletme mikroskobu yöntemini detaylandırır. Bu protokol, çoğu biyoloji laboratuvarında ve makine çekirdeği tesislerinde bulunan geleneksel mikroskoplarla uyumlu olma avantajı ile mevcut süper çözünürlüklü görüntüleme ve elektron mikroskobu tekniklerine bir alternatif sunar. Üç boyutlu rekonstrüksiyonu mümkün kılan görüntüleri elde etmek için çoğu araştırma laboratuvarı için ortak teknikler kullanır.
Protokol, tripanosomatidlerdeki nano ölçekli yapıların incelenmesini kolaylaştırır ve bir hücre popülasyonunun incelenmesine ve ilgilenilen bir hücrenin tüm hacminin yüksek çözünürlükte görüntülenmesine olanak tanır. Hücre döngüsünün ve farklılaşmasının geçici aşamalarında bilime özgü hücre tipleri için özellikle yararlıdır. Daha da fazla çözünürlük elde etmek için, 20 nanometrenin altındaki çözünürlüklere ulaşmak için ExM'nin süper çözünürlüklü mikroskobik tekniklerle kombinasyonunu kullanacağız.
% 10 FCS ile desteklenmiş LIT ortamında bir log faz kültüründen Trypanosoma cruzi epimastigot süspansiyonunu hazırlayarak başlayın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleyin. Peleti PBS ile iki kez yıkayın, ardından 200 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin.
Süspansiyonu Poli-D-Lizin ile kaplanmış yuvarlak 12 milimetrelik bir kapak kızağına yapıştırın ve çapraz bağlama önlemeden önce oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin. Enfeksiyondan dört gün sonra tripomastigotlarla enfekte olmuş bir Vero hücre tek tabakasının süpernatantını toplayın. Bir Neubauer hücre sayma odası kullanarak, tripomastigotların konsantrasyonunu belirleyin.
Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 7.000 G'de santrifüjleyin. Hücreleri PBS'de duruladıktan ve yeniden süspanse ettikten sonra, hücre süspansiyonunu lizin kaplı bir örtü kızağına aktarın ve çapraz bağlanma önlemeden önce örtü kızağını oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Enfekte Vero hücrelerinden amastigotlar elde etmek için, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının dibine steril bir 12 milimetre yuvarlak kapak fişi yerleştirin.
Daha sonra,% 2 FCS ile desteklenmiş DMEM'de bir Vero hücresi süspansiyonu hazırlayın ve her bir oyuğa 500 mikrolitre süspansiyon tohumlayın. Hücre yapışmasını sağlamak için plakayı gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 500 mikrolitre steril PBS ile iki kez yıkayın.
Hücrelere T.cruzi tripomastigotları ekleyin ve daha önce olduğu gibi altı saat inkübe edin. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0,5 mililitre çapraz bağlama önleme çözeltisi ekleyerek başlayın. Ardından, 12 milimetrelik Poli-D-Lizin kaplı kapak fişlerini yapışkan parazitlerle batırın.
Buharlaşmayı azaltmak için boş kuyuları suyla doldurduktan sonra, plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve inkübe edin. Numuneleri jelleştirmek için, önce kağıt mendilin üzerine bir sızdırmazlık filmi yerleştirerek bir Petri kabına nemli bir oda monte edin. Daha sonra kağıt mendili suyla ıslatın ve soğuması için eksi 20 derecede 20 dakika inkübe edin.
Soğuk nemli odayı buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, üç mililitrelik bir Pasteur pipeti kullanarak, 24 oyuklu plakanın kuyucuklarından çapraz bağlama önleme solüsyonunu aspire edin. Şimdi, kapak fişlerini çıkarmak için cımbız kullanın ve parazitler yukarı bakacak şekilde kağıt mendilin üzerine yerleştirin.
Bir tüpe 90 mikrolitre monomerik çözelti alın ve çözülmüş TEMED ve APS'nin her birine beş mikrolitre ekleyin. Karışımı iki ila üç saniye boyunca girdaplayın. Her bir kapak fişi için bu karışımdan 35 mikrolitre sızdırmazlık filminin üzerine pipetleyin ve kapak fişlerini parazitler aşağı bakacak şekilde damlanın üzerine yerleştirmek için hemen cımbız kullanın.
Nemli odayı buz üzerinde beş dakika, ardından bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna iki mililitre denatürasyon solüsyonu pipetleyerek başlayın. Trypanosoma cruzi parazitleri içeren jelleşmiş lamel örtüleri denatürasyon solüsyonuna aktarın ve hafif çalkalama ile inkübe edin.
Jel ayrılmasını teşvik etmek için. Metal bir spatula kullanarak, jeli dikkatlice bir mililitre denatürasyon çözeltisi içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü bir ısıtma bloğu üzerinde güvenli bir kapakla inkübe edin.
Mikrosantrifüj tüplerinden denatürasyon solüsyonunu aspire etmek için bir P1000 pipeti kullanın. Metal bir spatula ile jeli 10 mililitre ultra saf su içeren bir Petri kabına aktarın ve 30 dakika bekletin. Üç mililitrelik tek kullanımlık Pasteur pipeti kullanarak, tabaktaki ultra saf suyu değiştirin ve jeli gece boyunca oda sıcaklığında suya batırın.
Ertesi gün, genleşmeyi hesaplamak için jel çapını bir kumpas ile ölçün. Numuneler, suda 4 ila 4,5 kat genişleyen düzlemsel ve yarı saydam bir jel olarak görülebildi. Parazitleri içeren genişletilmiş jel halkalarını PBS ile yıkayarak floresan etiketlemeye başlayın.
Merkezdeki daireleri 10'a 10 milimetre kareler halinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Şimdi, her kareyi 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve% 2 PBS ve BSA'da seyreltilmiş primer antikorun 500 mikrolitresinde çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra, jel karelerini,% 0.1 polisorbat 20 ile iki mililitre PBS içeren altı oyuklu bir plakada 10 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.
Jeli 12 oyuklu bir plakaya aktardıktan sonra, DAPI ile PBS'ye 500 mikrolitre ikincil antikor ve istenen florofora konjuge edilmiş mililitre NHS esteri başına 10 mikrogram ekleyin. Jeli hafif çalkalama altında 37 santigrat derecede 2.5 saat inkübe edin. Jeli daha önce olduğu gibi PBS polisorbat 20 içinde üç kez yıkadıktan sonra, jeli ultra saf su ile bir Petri kabına aktarın ve 30 dakika inkübe edin.
Genişletilmiş jel parçasının 10 x 10 milimetre karesini 35 milimetrelik bir alt tabağa yerleştirin. Parazitlerin yönünü 10 veya 20X büyütmede kontrol edin. Numuneleri, 1.4 sayısal açıklığa sahip 63X yağa daldırma objektifi ile konfokal bir mikroskopta görüntüleyin.
Z yığınlarını, her bir Z adımının genişliğini ve piksel başına ampirik olarak belirlenen pozlama süresini elde edin, ardından istenirse etkili büyütme için tarama yakınlaştırmasını kullanarak sinyal yoğunluğunu ve çekim sürelerinin optimizasyonunu elde edin. Görüntü işleme yazılımını kullanarak Z yığınını açın ve her kanal için grup Z projesi seçeneğini kullanarak yığınlanmış görüntüleri gruplandırın. Ardından, maksimum yoğunluk projeksiyonunu seçin.
Kanalları Birleştir aracını kullanarak görüntüleri birleştirin. Her kanalın rengini seçin ve işleme yazılımındaki Ölçek Çubuğu aracını kullanarak ölçek çubuğunu ekleyin. Birincil genişleme, 70 nanometrelik etkili bir çözünürlük sağlarken, ikincil genişleme, yaklaşık 4.5'lik genleşme faktörleri gösterdi.
T.cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşamasının da hücre iskeleti belirteçleri ile boyanması, proteinin mikrotübüler korse ve flagellar akson lokalizasyonunu gösterdi. Kromatin yoğunlaşması, DAPI ile boyandığında açıkça ayırt edildi. Epimastigotlarda pan proteom işaretlemesi ile örtüşen alfa tübülin belirteçlerinin immünolokalizasyonu, anti-alfa-tübulin ve FITC ile boyanmış bazal gövdenin bölündüğünü gösterdi.
Pan proteom etiketlemesi, tüm yaşam döngüsü aşamalarında farklı parazit yapılarının tanımlanmasına yardımcı oldu.
