Este protocolo detalha o método de microscopia de expansão de ultraestrutura em três estágios do ciclo de vida in vitro do Trypanosoma cruzi, o patógeno responsável pela doença de Chagas. Este protocolo oferece uma alternativa às atuais técnicas de imagem de super resolução e microscopia eletrônica, com a vantagem de ser compatível com microscópios convencionais encontrados na maioria dos laboratórios de biologia e em instalações de núcleo de máquinas. Ele usa técnicas comuns para a maioria dos laboratórios de pesquisa para obter imagens que permitem a reconstrução tridimensional.
O protocolo facilita o estudo de estruturas em nanoescala em tripanossomatídeos, permitindo a inspeção de uma população de células e a obtenção de imagens de todo o volume de uma célula de interesse em alta resolução. É particularmente útil para tipos de células específicas da ciência em fases transitórias do ciclo celular e diferenciação. Para obter ainda mais resolução, usaremos a combinação de ExM com técnicas microscópicas de super resolução para atingir resoluções abaixo de 20 nanômetros.
Começar preparando a suspensão epimastigota de Trypanosoma cruzi a partir de uma cultura em fase logarítmica em meio LIT suplementado com 10%FCS. Centrifugar a suspensão a 5 000 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lave o pellet duas vezes com PBS e ressuspenda em 200 microlitros de PBS.
Aderir a suspensão a uma lamínula redonda de 12 milímetros revestida com Poli-D-Lisina e incubá-la à temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos antes da prevenção da reticulação. Colete o sobrenadante de uma monocamada de células Vero infectada com os tripomastigotas quatro dias após a infecção. Usando uma câmara de contagem de células de Neubauer, determine a concentração dos tripomastigotas.
Centrifugar a suspensão da célula a 7 000 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Depois de enxaguar e ressuspender as células em PBS, transfira a suspensão da célula para uma lamínula revestida de lisina e incube a lamínula à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos antes da prevenção de reticulação. Para obter amastigotas de células Vero infectadas, coloque uma lamínula redonda estéril de 12 milímetros no fundo de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
Em seguida, prepare uma suspensão de células Vero em DMEM suplementada com 2%FCS e semeie 500 microlitros da suspensão em cada poço. Incube a placa durante a noite para garantir a fixação da célula. Em seguida, lave as células duas vezes com 500 microlitros de PBS estéril.
Adicione tripomastigotas de T.cruzi nas células e incube como antes por seis horas. Comece adicionando 0,5 mililitros de solução de prevenção de reticulação a cada poço de uma placa de 24 poços. Em seguida, mergulhe as lamínulas revestidas com poli-D-lisina de 12 milímetros com parasitas aderentes.
Depois de encher os poços vazios com água para reduzir a evaporação, sele a placa com uma película de vedação e incuba. Para gelar as amostras, primeiro monte uma câmara úmida em uma placa de Petri, colocando um filme de vedação em cima do papel de seda. Em seguida, molhe o lenço de papel com água e incube a menos 20 graus Celsius por 20 minutos para resfriá-lo.
Coloque a câmara úmida fria no gelo. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur de três mililitros, aspire a solução de prevenção de reticulação dos poços da placa de 24 poços. Agora, use uma pinça para remover as lamínulas e coloque-as sobre o papel de seda com os parasitas voltados para cima.
Pegue 90 microlitros de solução monomérica em um tubo e adicione cinco microlitros de TEMED e APS descongelados. Vortex a mistura por dois a três segundos. Pipete 35 microlitros dessa mistura sobre o filme de vedação para cada lamínula e use imediatamente uma pinça para colocar as lamínulas sobre a gota com os parasitas voltados para baixo.
Incube a câmara úmida no gelo por cinco minutos e, em seguida, a 37 graus Celsius por uma hora. Comece pipetando dois mililitros de solução de desnaturação em cada poço de uma placa de seis poços. Transferir as lamínulas gelificadas contendo parasitas do Trypanosoma cruzi para a solução de desnaturação e incubar com agitação suave.
Para estimular o descolamento do gel. Usando uma espátula de metal, transfira cuidadosamente o gel para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro da solução de desnaturação. Incube o tubo com uma tampa segura em um bloco de aquecimento.
Use uma pipeta P1000 para aspirar a solução de desnaturação dos tubos da microcentrífuga. Com uma espátula de metal, transfira o gel para uma placa de Petri contendo 10 mililitros de água ultrapura e deixe por 30 minutos. Usando uma pipeta Pasteur descartável de três mililitros, substitua a água ultrapura no prato, deixando o gel submerso durante a noite em temperatura ambiente.
No dia seguinte, meça o diâmetro do gel com um paquímetro para calcular a expansão. As amostras eram visíveis como um gel planar e translúcido que se expandiu de 4 a 4,5 vezes na água. Comece a rotulagem fluorescente lavando os círculos de gel expandido contendo os parasitas com PBS.
Use uma lâmina de barbear para cortar os círculos no centro em quadrados de 10 por 10 milímetros. Agora, transfira cada quadrado para uma placa de 12 poços e incube-o em 500 microlitros do anticorpo primário diluído em 2% PBS e BSA, com agitação. Em seguida, incube os quadrados de gel em uma placa de seis poços contendo dois mililitros de PBS com 0,1% de polissorbato 20 por 10 minutos, agitando.
Depois de transferir o gel para uma placa de 12 poços, adicione 500 microlitros de anticorpo secundário em PBS com DAPI e 10 microgramas por mililitro de éster NHS conjugado ao fluoróforo desejado. Incube o gel por 2,5 horas a 37 graus Celsius sob agitação suave. Depois de lavar o gel três vezes em polissorbato PBS 20 como anteriormente, transfira o gel para uma placa de Petri com água ultrapura e incube por 30 minutos.
Coloque um quadrado de 10 por 10 milímetros da peça de gel expandida em um prato inferior de 35 milímetros. Verifique a orientação dos parasitas com aumento de 10 ou 20X. Visualize as amostras em um microscópio confocal com uma objetiva de imersão em óleo de 63X, com abertura numérica de 1,4.
Adquira pilhas Z, a largura de cada passo Z e o tempo de exposição empiricamente determinado por pixel e, em seguida, adquira a intensidade do sinal e a otimização dos tempos de aquisição usando o zoom de varredura para ampliação efetiva, se desejar. Abra a pilha Z usando o software de processamento de imagem e agrupe as imagens empilhadas usando a opção de projeto do grupo Z para cada canal. Em seguida, selecione a projeção de intensidade máxima.
Mescle imagens usando a ferramenta Mesclar canais. Selecione a cor de cada canal e adicione a barra de escala usando a ferramenta Barra de escala no software de processamento. A expansão primária forneceu uma resolução efetiva de 70 nanômetros, enquanto a expansão secundária mostrou fatores de expansão em torno de 4,5.
A coloração de todos os três estágios do ciclo de vida in vitro do T. cruzi com marcadores do citoesqueleto mostrou a localização do espartilho microtubular e do axonema flagelar da proteína. A condensação da cromatina foi claramente distinguida quando corada com DAPI. A imunolocalização dos marcadores da tubulina alfa sobreposta à marcação do pan proteoma em epimastigotas mostrou que o corpo basal corado com anti-alfa-tubulina e FITC havia se dividido.
A marcação do proteoma Pan ajudou a identificar diferentes estruturas do parasita em todos os estágios do ciclo de vida.
