이 프로토콜은 샤가스병의 원인이 되는 병원체인 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)의 3가지 체외 수명 주기 단계에서 초구조 확장 현미경 검사 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 현재의 초고해상도 이미징 및 전자 현미경 기술에 대한 대안을 제공하며, 대부분의 생물학 실험실 및 기계 핵심 시설에서 볼 수 있는 기존 현미경과 호환된다는 장점이 있습니다. 대부분의 연구 실험실에서 일반적인 기술을 사용하여 3차원 재구성을 가능하게 하는 이미지를 얻습니다.
이 프로토콜은 트리파노소마티드의 나노 스케일 구조 연구를 용이하게 하여 세포 집단을 검사하고 관심 세포의 전체 부피를 고해상도로 이미징할 수 있습니다. 이는 세포 주기의 과도기 단계 및 분화에 있는 과학 특정 세포 유형에 특히 유용합니다. 더 많은 해상도를 얻기 위해 20나노미터 미만의 해상도에 도달하기 위해 ExM과 초고해상도 현미경 기술의 조합을 사용할 것입니다.
먼저 10%FCS가 보충된 LIT 배지의 로그 상 배양에서 Trypanosoma cruzi epimastigote 현탁액을 준비합니다. 5, 실온에서 10분 동안 000G에서 서스펜션을 원심분리하십시오. 펠릿을 PBS로 두 번 세척한 다음 PBS 200마이크로리터에 재현탁합니다.
Poly-D-Lysine으로 코팅된 둥근 12mm 커버 슬립에 서스펜션을 부착하고 가교 방지 전에 실온에서 15-20분 동안 배양합니다. 감염 4일 후 트리포마스티고테스에 감염된 Vero 세포 단층의 상층액을 수집합니다. Neubauer 세포 계수 챔버를 사용하여 트리포마스티고테스의 농도를 측정합니다.
실온에서 7, 000G에서 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. PBS에서 세포를 헹구고 재현탁시킨 후 세포 현탁액을 라이신으로 코팅된 커버 슬립으로 옮기고 가교 방지 전에 커버 슬립을 실온에서 10-15분 동안 배양합니다. 감염된 Vero 세포에서 아마스티고테스를 얻으려면 24웰 조직 배양 플레이트의 바닥에 멸균 12mm 원형 커버 슬립을 놓습니다.
다음으로, 2%FCS가 보충된 DMEM에서 Vero 세포의 현탁액을 준비하고 각 웰에 현탁액 500마이크로리터를 시딩합니다. 세포가 부착될 수 있도록 플레이트를 밤새 배양합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
T.cruzi trypomastigotes를 세포에 첨가하고 6시간 동안 이전과 같이 배양합니다. 먼저 24웰 플레이트의 각 웰에 0.5ml의 가교 방지 솔루션을 추가합니다. 그런 다음 12mm Poly-D-Lysine 코팅 커버 슬립을 부착 된 기생충에 담그십시오.
증발을 줄이기 위해 빈 우물에 물을 채운 후 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉하고 배양합니다. 샘플을 겔화하려면 먼저 티슈 페이퍼 위에 밀봉 필름을 올려 페트리 접시에 습한 챔버를 조립합니다. 그런 다음 티슈 페이퍼를 물에 적시고 섭씨 영하 20도에서 20분 동안 배양하여 식힙니다.
시원하고 습한 챔버를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 3 밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 24 웰 플레이트의 웰에서 가교 방지 용액을 흡입합니다. 이제 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거하고 기생충이 위를 향하도록 티슈 페이퍼 위에 놓습니다.
튜브에 90마이크로리터의 단량체 용액을 넣고 해동된 TEMED와 APS를 각각 5마이크로리터씩 추가합니다. 혼합물을 2-3초 동안 소용돌이치십시오. 이 혼합물을 35마이크로리터의 피펫으로 각 커버 슬립의 밀봉 필름 위에 바르고 즉시 핀셋을 사용하여 기생충이 아래를 향하도록 드롭 위에 커버 슬립을 놓습니다.
습한 챔버를 얼음 위에서 5분 동안 배양한 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 먼저 2ml의 변성 용액을 6웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. Trypanosoma cruzi 기생충이 포함된 겔화된 커버 슬립을 변성 용액에 옮기고 부드러운 교반으로 배양합니다.
젤 분리를 촉진합니다. 금속 주걱을 사용하여 1.5ml의 변성 용액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 겔을 조심스럽게 옮깁니다. 가열 블록에 단단히 고정된 캡으로 튜브를 배양합니다.
P1000 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 변성 용액을 흡입합니다. 금속 주걱을 사용하여 젤을 초순수 10ml가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 30분 동안 그대로 둡니다. 3 밀리리터의 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시의 초순수를 교체하고 젤을 실온에서 밤새 담가 둡니다.
다음날, 캘리퍼로 겔 직경을 측정하여 팽창을 계산합니다. 샘플은 물에서 4배에서 4.5배 팽창하는 평면 및 반투명 젤로 볼 수 있었습니다. 기생충을 포함하는 팽창된 젤 서클을 PBS로 세척하여 형광 라벨링을 시작합니다.
면도날을 사용하여 중앙의 원을 10 x 10mm 정사각형으로 자릅니다. 이제 각 사각형을 12웰 플레이트로 옮기고 2%PBS 및 BSA로 희석된 1차 항체 500마이크로리터에 진탕하여 배양합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 PBS가 함유 된 6 웰 플레이트에 0.1 % 폴리 소르 베이트 20을 10 분 동안 진탕하면서 겔 사각형을 배양합니다.
겔을 12웰 플레이트로 옮긴 후 DAPI가 있는 PBS에 500마이크로리터의 2차 항체를 추가하고 원하는 형광단에 접합된 NHS 에스테르 밀리리터당 10마이크로그램을 추가합니다. 부드러운 교반 하에서 섭씨 37도에서 2.5시간 동안 젤을 배양합니다. 이전과 같이 PBS 폴리소르베이트 20에서 젤을 세 번 세척한 후 초순수가 담긴 페트리 접시에 젤을 옮기고 30분 동안 배양합니다.
10 x 10mm 정사각형의 팽창된 젤 조각을 35mm 바닥 접시에 놓습니다. 10배 또는 20배 배율에서 기생충의 방향을 확인합니다. 1.4 numerical aperture를 가진 63X 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경으로 샘플을 이미지화합니다.
Z-스택, 각 Z-스텝의 너비 및 픽셀당 경험적으로 결정된 노출 시간을 획득한 다음, 원하는 경우 효과적인 배율을 위해 스캔 줌을 사용하여 신호 강도 및 획득 시간 최적화를 획득합니다. 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 Z-스택을 열고 각 채널에 대해 그룹 Z 프로젝트 옵션을 사용하여 스택된 이미지를 그룹화합니다. 그런 다음 최대 강도 투영을 선택합니다.
채널 병합 도구를 사용하여 이미지를 병합합니다. 각 채널의 색상을 선택하고 프로세싱 소프트웨어의 Scale Bar 도구를 사용하여 스케일 바를 추가합니다. 1차 팽창은 70나노미터의 유효 분해능을 제공한 반면, 2차 팽창은 약 4.5의 팽창 계수를 보여주었습니다.
T.cruzi의 세 가지 in vitro 수명 주기 단계를 모두 세포골격 마커로 염색하면 단백질의 미세소관 코르셋과 편모 축삭돌기 국소화가 나타났습니다. 염색질 축합은 DAPI로 염색할 때 명확하게 구별되었습니다. epimastigotes에서 팬 프로테옴 표지와 중첩된 알파 튜불린 마커의 면역 국소화는 anti-alpha-tubulin과 FITC로 염색된 기저체가 분열되었음을 보여주었습니다.
팬 프로테옴 라벨링은 모든 수명 주기 단계에서 다양한 기생충 구조를 식별하는 데 도움이 되었습니다.
