このプロトコルでは、シャーガス病の原因となる病原体であるTrypanosoma cruziの3つのin vitroライフサイクルステージにおける超微細構造拡大顕微鏡法を詳述しています。このプロトコルは、現在の超解像イメージングおよび電子顕微鏡技術に代わるものであり、ほとんどの生物学研究室や機械のコア施設で見られる従来の顕微鏡と互換性があるという利点があります。ほとんどの研究室で一般的な手法を使用して、3次元再構成を可能にする画像を取得します。
このプロトコルは、トリパノソーマチドのナノスケール構造の研究を容易にし、細胞集団の検査を可能にし、目的の細胞の全容積を高解像度でイメージングします。これは、細胞周期と分化の過渡期にある科学特異的な細胞タイプに特に有用です。さらに解像度を上げるために、ExMと超解像顕微鏡技術を組み合わせて、20ナノメートル未満の解像度に到達します。
まず、10%FCSを添加したLIT培地で対数期培養物からTrypanosoma cruziエピマスティゴート懸濁液を調製します。懸濁液を室温で10分間、5, 000Gで遠心分離します。ペレットをPBSで2回洗浄し、次に200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
Poly-D-Lysineをコーティングした丸い12mmカバースリップに懸濁液を接着し、室温で15〜20分間インキュベートしてから架橋防止します。感染の4日後にトリポマスティゴテスに感染したベロ細胞単層の上清を収集します。.ノイバウアー細胞計数チャンバーを使用して、トリポマスティゴートの濃度を測定します。
細胞懸濁液を室温で10分間7, 000Gで遠心分離します。PBSで細胞をすすぎ、再懸濁した後、細胞懸濁液をリジンコーティングしたカバースリップに移し、クロスリンク防止のために室温で10〜15分間インキュベートします。感染したVero細胞からアマスチゴテスを得るには、24ウェル組織培養プレートの底に滅菌済みの12mm丸型カバースリップを置きます。
次に、2%FCSを添加したDMEM中のVero細胞の懸濁液を調製し、500マイクロリットルの懸濁液を各ウェルに播種します。プレートを一晩インキュベートして、細胞の付着を確認します。次に、500マイクロリットルの滅菌PBSで細胞を2回洗浄します。
T.cruzi trypomastigotesを細胞に加え、前と同じように6時間インキュベートします。まず、0.5 mLの架橋防止液を24ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、12mmのPoly-D-Lysineコーティングされたカバースリップに付着性寄生虫を浸します。
蒸発を減らすために空の井戸に水を入れた後、プレートをシーリングフィルムで密封し、インキュベートします。サンプルをゲル化するには、まずティッシュペーパーの上にシーリングフィルムを貼って、シャーレに湿ったチャンバーを組み立てます。その後、ティッシュペーパーを水で濡らし、マイナス20°Cで20分間インキュベートして冷まします。
冷たく湿ったチャンバーを氷の上に置きます。次に、3ミリリットルのパスツールピペットを使用して、24ウェルプレートのウェルから架橋防止溶液を吸引します。次に、ピンセットを使用してカバースリップを取り外し、寄生虫を上に向けてティッシュペーパーの上に置きます。
チューブに90マイクロリットルのモノマー溶液を取り、解凍したTEMEDとAPSをそれぞれ5マイクロリットル加えます。混合物を2〜3秒間ボルテックスします。各カバースリップのシーリングフィルム上でこの混合物の35マイクロリットルをピペットで移動し、すぐにピンセットを使用して、寄生虫が下を向いているドロップの上にカバースリップを置きます。
湿ったチャンバーを氷上で5分間インキュベートし、次に摂氏37度で1時間インキュベートします。まず、2ミリリットルの変性溶液を6ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。Trypanosoma cruzi寄生虫を含むゼリー状のカバースリップを変性溶液に移し、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
ゲルの剥離を促します。金属製のスパチュラを使用して、1ミリリットルの変性溶液が入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブにゲルを慎重に移します。加熱ブロックに固定されたキャップでチューブをインキュベートします。
P1000ピペットを使用して、微量遠心チューブから変性溶液を吸引します。金属製のヘラで、10ミリリットルの超純水が入ったシャーレにゲルを移し、30分間放置します。3ミリリットルの使い捨てパスツールピペットを使用して、皿の中の超純水を交換し、ゲルを室温で一晩沈めます。
翌日、キャリパーでゲルの直径を測定し、膨張を計算します。サンプルは、水中で4〜4.5倍に膨張する平面的で半透明のゲルとして見えました。蛍光標識は、寄生虫を含む膨張したゲルサークルをPBSで洗浄することから始めます。
かみそりの刃を使用して、中心の円を10 x 10ミリメートルの正方形に切ります。次に、各正方形を12ウェルプレートに移し、2%PBSおよびBSAで希釈した一次抗体500マイクロリットルで振とうしながらインキュベートします。次に、2ミリリットルのPBSを含む6ウェルプレートで、0.1%ポリソルベート20を含むゲルスクエアを10分間、振とうしながらインキュベートします。
ゲルを12ウェルプレートに移した後、DAPIを含むPBS中の500マイクロリットルの二次抗体と、目的の蛍光色素に結合した1ミリリットルあたり10マイクログラムのNHSエステルを添加します。穏やかに攪拌しながら、ゲルを摂氏37度で2.5時間インキュベートします。先ほどと同様にPBSポリソルベート20でゲルを3回洗浄した後、超純水を入れたペトリ皿にゲルを移し、30分間インキュベートします。
10 x 10 mm四方の膨張ジェルピースを35 mmの底の皿に置きます。寄生虫の向きを10倍または20倍の倍率で確認してください。開口数1.4の63倍油浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡でサンプルをイメージングします。
Zスタック、各Zステップの幅、およびピクセルあたりの経験的に決定された露光時間を取得し、必要に応じてスキャンズームを使用して信号強度と取得時間の最適化を取得し、効果的な倍率を実現します。画像処理ソフトウェアを使用してZスタックを開き、各チャンネルのグループZプロジェクトオプションを使用して、スタックされた画像をグループ化します。次に、最大強度の投影を選択します。
[チャネルの結合] ツールを使用して画像を結合します。各チャンネルの色を選択し、処理ソフトウェアのスケールバーツールを使用してスケールバーを追加します。一次膨張は70ナノメートルの有効分解能を提供し、二次膨張は約4.5の膨張係数を示しました。
T.cruziの3つのin vitroライフサイクルステージすべてを細胞骨格マーカーで染色すると、タンパク質の微小管コルセットとべん毛軸索の局在が示されました。クロマチン凝縮は、DAPIで染色すると明確に区別されました。エピマスティゴテにおけるパンプロテオーム標識と重なったαチューブリンマーカーの免疫局在は、抗α-チューブリンとFITCで染色された基底体が分裂していることを示した。
Pan Proteome Labelingは、すべてのライフサイクル段階でさまざまな寄生虫構造を特定するのに役立ちました。
