אנו מודים לרוברט טג'יאן וחאווייר דרזק על תמיכתם והשימוש בציוד מעבדה. אנו מודים למארק קיי על תרומתו לפלסמידים KP1 ו- LK03 rep/cap, וללוק ונדנברגה על פלסמיד AAV4 rep/cap. המימון ניתן על ידי המכון הרפואי הווארד יוז (34430, R. T.) והמכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית תוכנית הכשרה EDUC4-12790. נ.ו. מודה על מימון ממרכז תאי הגזע בברקלי באמצעות מלגת סיבל לפוסט-דוקטורט ומקרן המחקר הגרמנית (DFG) באמצעות מלגת וולטר בנימין.

ייצור וקטורי גולמי והעברת DNA יעילה בתרביות תאים

A.C.M. היא יועצת עבור Janssen Pharmaceuticals ומכהנת ב-SAB עבור NewBiologix. לכל שאר המחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

שיבוט פרוטוקול השיבוט אינו מוגבל לפלסמיד pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 המשמש לעיל וניתן לשנות אותו בקלות בהתבסס על צרכי הניסוי של החוקר. פלסמידים רבים המכילים ITR זמינים באינטרנט לרכישה. לדוגמה, פלסמידים המכילים גם Cas9 וגם אתר שיבוט sgRNA זמינים אך דורשים כמה שלבים נוספים כגון חישול אוליגונוקלאוטיד וטיפול PNK30. בנוסף, ניתן למצוא פלסמידים המכילים אתר שיבוט מרובה (MCS) עם ITR בלבד וללא אלמנטים רגולטוריים פנימיים31. אם רוצים להשתמש בפלסמידים שונים, אנזימי ההגבלה (RE) המשמשים לעיכול הם בדרך כלל המרכיבים היחידים שייתכן שיהיה צורך לשנות בפרוטוקול זה. עם זאת, מגבלה של rAAV היא קיבולת המטען המוגבלת שלה. בשל מגבלות פיזיות של הקפסיד, הגנום הווקטורי לא יעלה על 4.9 קילובייט, כולל ITR.
בעת בידוד פלסמיד מחיידקים, חיוני להשתמש בערכת midiprep או maxiprep נמוכה או נטולת אנדוטוקסין כדי להפחית את הנזק לתאים במהלך טרנספקציה או התמרה של פלסמיד משולש. פלסמיד מערכות miniprep מכיל לעתים קרובות זיהומים גבוהים יותר, ריכוזים מופחתים, ופחות DNA סליל, כל אלה יכולים להשפיע על הייצור במורד הזרם של rAAV ולכן אינו מומלץ.
זה קריטי להבין את המבנה והמאפיינים של ITR במהלך השיבוט. ראשית, קשה מאוד להשתמש ב- PCR באמצעות ITR. יש להימנע מעיצובי שיבוט הדורשים הגברה של PCR באמצעות ITR, ובנוסף להגביל את השימוש בטכניקת שיבוט ההרכבה של גיבסון. ככזה, שיבוט אנזים הגבלה הוא השיטה המועדפת לשיבוט לפלסמידים המכילים ITR. יתר על כן, פריימרים מסוימים לריצוף Sanger עשויים שלא להיות תואמים אם האזור הרצף מכיל את ITR. במקום זאת, מומלץ להשתמש בפריימרים שרצפים הרחק מה-ITR ולתוך גוף הגנום הווקטורי כדי לקבל תוצאות ריצוף מדויקות יותר. שנית, ITR מועדים למחיקות, סידורים מחדש ומוטציות כאשר הם הופכים לחיידקים להגברת פלסמיד32,33. כדי למתן אירועים אלה, מומלץ להשתמש בזני חיידקים מוכשרים חסרי רקומבינציה, כגון Stbl3, ולדגור עליהם בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי להאט את חלוקות התאים. לבסוף, נצפה כי מושבות קטנות יותר עשויות להתאים לשיבוטים ללא סידורים מחדש או מחיקות, שכן אלה ללא ITR עשויים להעניק יתרון צמיחה ולהיות גדולים יותר. לכן, מומלץ לבחור מושבות קטנות.
ייצור וקטורי הייצור המוצלח של וקטור rAAV יכול להיות מושפע ממספר אלמנטים. גורם קריטי אחד הוא בריאותם של תאי HEK293 או 293T המשמשים להעברה. באופן כללי, מספרי מעבר נמוכים הם אידיאליים, מכיוון שתאים בעלי מעבר גבוה עשויים להציג שונות גנוטיפית ופנוטיפית שיכולה להפחית את רמות ה-rAAV. בנוסף, צפיפות תאי הזרע צריכה להיות 75%-90% מפגש לייצור יעיל. תאים דלילים מייצרים תפוקות וקטוריות נמוכות מכיוון שיש פחות תאים זמינים לייצור וקטורים, בעוד שתאים מגודלים לא יהיו נגועים ביעילות.
שינויים בין מגרשים מגיבים, מלאי תאים, ושונות כללית ממעבדה למעבדה תורמים להבדלים ביעילות הטרנספקציה ובטיטר הייצור. גורם אופטימלי אחד שיכול להוביל לשיפור הטיטר הוא יחס פלסמיד:PEI בתגובות טרנספקציה. חיוני להשתמש ב-PEI MAX טרי (בן < חודש). מומלץ להשתמש ביחס פלסמיד:PEI של 1:1 כנקודת התחלה, ואם יעילות הטרנספקציה או הטרנסדוקציה נראית גרועה, בדוק מספר יחסים שונים. אופטימיזציה של Titer היא הקלה ביותר אם משתמשים בטרנסגן עם קריאה חזותית, כגון CMV.Luc.IRES.EGFP reporter trangene המשמש כאן כחומר מוצא לשיבוט. כדי לבצע את האופטימיזציה, בצע את שלב 3 של הפרוטוקול באמצעות צלחת של 12 בארות והקטנת מסות הפלסמיד ונפחי הריאגנט בשניים (מסת הפלסמיד הסופית היא 2.6 מיקרוגרם). כוונן את נפח PEI בהתאם כך שיתאים ליחסים הנעים בין 1:0.75 ל-1:3, עם דרגות הולכות וגדלות של 0.25 (איור 6). לדלל כל תגובה עם 950 μL של מדיה SF לאחר 15 דקות. לנוחיותכם, ניתן להכין תערובת מאסטר המכילה את הפלסמידים המשולשים ולהכניס בנפרד לצינורות של 1.5 מ"ל לפני הוספת קובץ משלים 2 של PEI-see. קצור את הווקטור, התמיר תאים בעלי עניין ותמונה. הבאר עם יעילות ההולכה הגבוהה ביותר (שיעור תאי GFP+) מתאימה לטיטר הגבוה ביותר וליחס האופטימלי ביותר של PEI:DNA.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig06.jpg"> איור 6: זרימת עבודה של אופטימיזציה של PEI. סכמה של השלבים הדרושים למיטוב PEI. יחסים מרובים של פלסמיד: PEI נבדקים כדי לקבוע את היחס האופטימלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
שיקולי קציר וטיטר טכניקת ההקפאה/הפשרה המשמשת לקצירת וקטור rAAV מבליחה ביעילות תאי HEK293 באופן התואם את השימוש הישיר בליזט המזוקק כדי להתמיר תאים בתרבית. סרוטיפים מסוימים של rAAV, כגון AAV1, AAV8 ו-AAV9 משתחררים מתאים במהלך הייצור הווקטורי וניתן לקצור אותם מתווך התא בתרבית ללא מחזורי הקפאה/הפשרה34. השיטה המתוארת כאן מניבה בדרך כלל טיטרים בסדר גודל של 1 x 10 10 VG/mL בעת שימוש בקפסידים AAV2, ו- 1 x10 11 VG/mL עבור AAV8. בעוד טיטרים גבוהים יותר ניתן להשיג על ידי דטרגנט או ליזה כימית אחרת, אלה מזיקים לתאים בשימוש במורד הזרם דורשים rAAV להיות מטוהרים עוד יותר מן הליזט. טיטר תחתון הוא פשרה אחת שחוקר צריך לשקול כאשר הוא קובע אם תכשירים גולמיים מתאימים לצרכי המחקר שלהם, עם זאת, טיטרים נמוכים יותר באופן שולי המיוצרים על ידי השיטות המתוארות כאן יכולים להתמיר סוגי תאים רבים היטב (ראה תוצאות מייצגות). בנוסף ליעילות הטרנספקציה ובריאות התא, טיטרים וקטוריים משתנים בהתאם לקפסיד המשמש במהלך ייצור rAAV ולגודל ולרצף של הטרנסגן בתוך VG35.
בעת קצירת תכשירים וקטוריים גולמיים, DNA פלסמיד ששימש במהלך טרנספקציה פלסמיד משולש עשוי להיות נוכח, ולמרות שהוא נדיר, לגרום לטרנספקציה במורד הזרם במהלך הטרנסדוקציה. יתר על כן, VGs לא ארוזים עשויים להיקשר לחלק החיצוני של קפסידים ולעורר תגובה חיסונית מולדת לדנ"א חד-גדילי עירום וזר36,37. לכן, סוגי תאים רגישים עשויים לדרוש תכשירים וקטוריים להיות מעוכלים ומטוהרים DNase כדי להסיר VGs ופלסמיד לא ארוזים.
אם רוצים לחשב את הטיטר של תכשיר גולמי, ניתן לבצע qPCR כדי לכמת את מספר VG ארוז בתוך חלקיקים עמידים בפני DNase (DRP). בקצרה, כמות קטנה של הכנה גולמית מתעכלת DNase כדי להסיר DNA פלסמיד, חומצות גרעין מזהמות, או VG ארוז חלקית. לאחר מכן הדגימה כפופה ל-qPCR וה-VG המוגן בתוך DRPs מכומת, והתוצאה היא טיטר עם יחידות של גנום וקטורי לכל מ"ל של הכנה גולמית38. לא מומלץ לבצע טיטרציה וקטורית באמצעות בדיקות מבוססות ELISA המכמתות את הטיטרים של קפסיד. בהשוואה לנגיף AAV מסוג פראי, rAAV סובל משיעור של קפסידים ריקים וארוזים חלקית39. ELISA תכמת את כל הקפסידים ללא קשר לתכולת הגנום שלהם ותעריך יתר על המידה את היחידות המתומרות הקיימות בהכנה, הדורשת VG ארוז.
שיקולי התמרה גורמים רבים משפיעים על התמרה של rAAV ויש לקחת בחשבון כל ניסוי חדש. בהתאם למקדם המניע את ביטוי הטרנסגנים, הופעת הביטוי יכולה להתרחש כבר 4 שעות לאחר הטרנסדוקציה (hpt), וביטוי שיא מושג בדרך כלל על ידי 48 hpt. חשוב לזכור את משך הזמן מהזריעה הראשונית של התאים ועד לנקודת הסיום של הניסוי. זאת כדי להעריך את המפגש ההתחלתי של התאים ולוודא שהם לא יגדלו יתר על המידה עד סוף הניסוי. אם התאים מתמזגים יתר על המידה, ההתנהגות התאית עשויה להשתנות עקב תגובת סטרס ויכולה לבלבל את תוצאות הניסוי. סוגי תאים מסוימים, כמו U2-OS, יכולים לסבול צמיחת יתר/עיכוב מגע די טוב. בנוסף, הם יכולים לעמוד בפרקי זמן ארוכים (48 שעות+) בתווך ממוזג ללא סרום - תוצר של פרוטוקול ייצור זה. עם זאת, סוגי תאים רגישים עשויים לדרוש הוספה בסרום או דילול של ההכנה הגולמית עם מדיום גידול מיוחד כדי לשמור על הבריאות במהלך ההעברה. יעילות התמרה מופחתת מעט משימוש במדיה המכילה סרום היא פשרה פוטנציאלית לבריאות התא ויש לשקול אותה על ידי החוקר.
בדרך כלל, עבור תאים המתחלקים במהירות, מפגש התחלתי של כ -50% הוא אופטימלי עבור יישומים שיסתיימו 48 hpt. עם זאת, ניתן להתאים את המפגש בהתאם לצרכי הניסוי. לא מומלץ להתמיר קווי תאים אימורטליים מסוג חד-שכבתי מעל 75% מפגש עקב ירידה ביעילות הטרנסדוקציה. רוב סוגי התאים בתרבית מומרים בהצלחה ובריאים לאחר דגירה של לילה עם תכשירי rAAV גולמיים, ולאחר מכן שינוי למדיה טרייה המכילה סרום בבוקר.
סרוטיפ קפסיד הוא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ייצור rAAV כדי להתמיר תא מטרה, שכן הקפסיד הוא הגורם העיקרי של טרופיזם תאי וביטוי טרנסגנים לאחר מכן13. AAV2 הוא סרוטיפ בשימוש נרחב בשל יכולתו להתמיר ביעילות סוגים רבים של תאים בתרבית12. ניתן לייחס תכונה זו של AAV2 לפרוטאוגליקנים של הפרין סולפט (HSPGs) המשמשים כגורם ההתקשרות העיקרי עבור AAV2 ולרמות הגבוהות של HSPGs על תאים בתרבית מההסתגלות לגידול בצלחת40. קפסידים אחרים, כגון AAV9, יעילים פחות בהתמרת סוגי תאים רחבים ועשויים להיות מוסברים על ידי גורמי התקשרות ההסתמכות שלהם שאינם באים לידי ביטוי בהגדרה זו41. לכן, אנו ממליצים על AAV2 כקפסיד הבחירה הראשונה בתאים בתרבית אם תא יעד רצוי לא נבדק בעבר עם rAAV בספרות.
שימו לב שמגבלה עיקרית של תכשירים וקטוריים גולמיים היא שהם אינם מתאימים להתמרה של מודלים של בעלי חיים. מחקרי In vivo דורשים הכנות לטיהור ולהערכת איכות.
ביטוי טרנסגנים ושיקולי אינטגרציה פוטנציאליים rAAVs אינם מביאים באופן אמין לביטוי קבוע של הטרנסגן. עם הזמן, VGs יכולים להיות מושתקים וביטוי מהונדס עשוי להיסגר בעקבות כמה קטעים42. בנוסף, רוב ה-VGs נשארים אפיזומליים, ו-rAAVs אינם מכילים את חלבוני ה-Rep הנגיפיים שיתוווכו אינטגרציה תכופה בגנום המארח כמו בזיהום ליזוגני נגיפי מסוג פראי או יקדמו שכפול של VGs43. כתוצאה מכך, אפיזומים בתאים מותמרים ידוללו בסופו של דבר בין תאי הבת באמצעות חלוקות.
אינטגרציה ברמת הבסיס היא אפשרות לכל חומר הדנ"א המהונדס המועבר. עם זאת, VGs המכילים ITR נוטים לאינטגרציה בתדר גבוה יותר44. לכן, ביטוי קבוע של טרנסגן ניתן לראות בתת-קבוצה קטנה של תאים. משתמשים צריכים לשקול אפשרות זו במיוחד בעת שימוש ב- rAAV כדי לספק אנזימים חותכי DNA, כגון Cas9, מכיוון שהפסקות דו-גדיליות עלולות לגרום לתדירות גדולה עוד יותר של אינטגרציה וביטוי קבוע45. בעוד שזה הופך את rAAV למועמד טוב לאספקת תבניות תיקון מכוונות הומולוגיה לתיוג אנדוגני או הוספת גנים, יש לשקול את האפשרות של החדרת Cas919,46.

בירור הבסיסים המולקולריים של תפקודים תאיים דורש לעתים קרובות ביטוי של דנ"א מהונדס בתרבית תאים. כדי לבוא לידי ביטוי, טרנסגנים חייבים לחדור דרך הממברנה הסלקטיבית של התא ולהגיע לגרעין 1,2. לכן, היכולת לעקוף ביעילות את המחסומים הפיזיים של התא ולתפעל את התהליכים המרכזיים שלו היא הכרחית ליישום טרנסגנזה כדי לחשוף תופעות ביולוגיות חדשות. גישה אחת מנצלת את היכולת הפנימית של נגיפים להעביר ולבטא דנ"א זר 3,4.
נגיף הקשור לאדנו (AAV) הוא אחד מנגיפי היונקים הקטנים ביותר: גנום הדנ"א החד-גדילי שלו, 4.7 קילו-בסיס (kb), מכיל שני גנים, rep (עבור רפליאז) ו-cap (עבור קפסיד), ארוזים בתוך קפסיד איקוסהדרלי של 60 מר בגודל 25 ננומטר. לגנים rep/cap יש מספר רב של מקדמים, מסגרות קריאה ומוצרי splice המקודדים לפחות תשעה חלבונים ייחודיים הדרושים לשכפול נגיפי, ייצור ואריזה 5,6. בנוסף, שני קצוות הגנום מכילים מבנים משניים הנקראים חזרות מסוף הפוכות (ITR) הנחוצים לשכפול DNA, אריזת גנום ועיבוד במורד הזרם במהלך התמרה 7,8,9,10. ה- ITR הם רכיבי ה- DNA היחידים הנדרשים לאריזת הגנום לתוך הקפסיד, ולכן ניתן לשכפל AAV למטרות העברת טרנסגנים על ידי החלפת הגנים החוזרים / כובע הנגיפים בבחירת החוקר של אלמנטים רגולטוריים ו / או גנים בעלי עניין6. ה-AAV הרקומביננטי (rAAV) המתקבל, עם גנום וקטורי מהונדס (VG), נמצא בשימוש נרחב במרפאה לטיפול גנטי אנושי וצבר הצלחות11. שימוש לא מוערך מספיק בווקטור נמצא במעבדה; rAAVs יכולים להשיג ביעילות ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית כדי למלא את צרכי הניסוי של החוקר12.
השיטה הנפוצה ביותר לייצור rAAV היא באמצעות טרנספקציה של פלסמיד משולש לתאי HEK293 או 293T (איור 1). הפלסמיד הראשון, המכונה בדרך כלל פלסמיד סיס, מכיל את הטרנסגן הרצוי משני צדדיו ITR (pAAV). בהתאם ליישום, פלסמידים סיס עם אלמנטים נפוצים, כגון מקדמים חזקים או כלים מבוססי קריספר, זמינים לרכישה. השני הוא פלסמיד pRep/Cap המכיל את הגנים מסוג פרא AAV rep ו-cap המסופקים בטרנס - כלומר, על פלסמיד נפרד, שאינו מכיל ITR המבטא אלמנטים רגולטוריים ומבניים המקיימים אינטראקציה עם פלסמיד סיס - ולכן נקרא פלסמיד טרנס. בנוסף לסגירה פיזית של VG, הקפסיד משפיע על טרופיזם תאי12,13. על ידי אספקת גן הכובע הספציפי לסרוטיפ בטרנס, החוקרים יכולים בקלות למקסם את יעילות ההולכה על ידי בחירת סרוטיפ קפסיד אופטימלי עבור תא היעד הנתון שלהם. לבסוף, כ-Dependoparvovirus, AAV דורש וירוס עוזר כדי להפעיל ביטוי rep/cap מהמקדמים הנגיפיים שלו, המושג על ידי גנים מסייעים אדנו-ויראליים, המסופקים על פלסמיד שלישי כגון pAdΔF614,15. לאחר 72 שעות של טרנספקציית פלסמיד משולש, הווקטור יכול להשתחרר מתאי היצרן למדיה התרבית על ידי מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים. לאחר מכן נאספים כל תכולת הצלחת, ופסולת תאית גדולה מוסרת באמצעות צנטריפוגה; הסופרנאטנט התקשורתי המתקבל הוא הכנת rAAV גסה המוכנה לתמריצים במורד הזרם.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg"> איור 1: סקירה כללית של ייצור וקטורי rAAV גולמי. ייצור rAAV גולמי וטרנסדוקציה ניתן לבצע בתוך 5 ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
rAAV עשוי להיות נוח יותר עבור העברת טרנסגנים בהשוואה לשיטות טרנספקציה אחרות, אשר קשורות בדרך כלל עם רעילות תאית, יעילות נמוכה, ריאגנטים יקרים וציוד, כגון עבור electroporation או transfection כימי / שומנים מבוססי16,17. rAAV עוקף מכשולים אלה ולעתים קרובות מספק ביטוי טרנסגנים חזק עם רעילות מינימלית, וזמן מעשי מינימלי. חשוב לציין, ייצור rAAV ויישומו בתרבית תאים הוא פשוט, ורק לעתים רחוקות דורש טיהור של הווקטור ממדיית התרבית (איור 1). בנוסף, rAAV אינו משלב את ה-VG שלו בגנום המארח, בניגוד להעברת טרנסגנים לנטיויראליים, ובכך מפחית את הסיכון למוטגנזה החדרתית18. למרות היתרונות הפוטנציאליים של שימוש ב- rAAV להעברת טרנסגנים, יש לקחת בחשבון מגבלות. חשוב לציין, גודל הטרנסגן, כולל ITRs, לא יעלה על 4.9 KB בשל אילוצים פיזיים של הקפסיד, ובכך להגביל את יכולתו של החוקר לספק ביעילות אלמנטים רגולטוריים גדולים וטרנסגנים. יתר על כן, מכיוון ש-rAAV הוא וירוס שאינו משתלב, התמרה גורמת לביטוי טרנסגנים חולפים בתאים מתחלקים ועשויה שלא להיות מעשית לביטוי יציב. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטות המשתמשות בתבניות Cas9 כפולות של rAAV ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR) כדי להכניס רצפים במיקומים גנומיים ספציפיים אם חוקר מעוניין בכך19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Snapgene DNA viewing sofrware</td>
			<td>Snapgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>105533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/2 (Rep/Cap)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>104963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAd&#916;F6</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boekel Scientific Economy Digital Incubator</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>133000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium, powder</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>113002042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbencillin (Disodium)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26 Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler nexus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6333000022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Provided with purchase of Phusion Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-100</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Provided with purchase of restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>Provided with purchase of T4 Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Microprocessor Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51221046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>149566B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1149Y01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZR Plasmid Miniprep - Classic</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xma1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0180S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sma1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Vortex Genie 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanyo Ultra Low Freezer</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>14656-15267-16219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCU-Line IL 10 with transparent window</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>strain #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>organoid growth medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Wnt-3A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeWo cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12K Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepa1-6</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>UC Berkeley BSD Cell Culture Facility</td>
			<td>HUH-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2C12</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSkMC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-950-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-23060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Differentiation Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-23061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;EVOS Digital Color Fluorescence Microscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-563-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoPlate 96-well</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/5 (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>104964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/8 (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>130878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/9n (Rep/Cap)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAnc80L65AAP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KP1 (rep/cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LK03 (rep/cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV4 (rep/cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Cas9.sgRNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.MCS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlock (synthetic DNA fragement)</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgene expression in cultured cells using unpurified recombinant adeno-associated viral vectors

וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) יכולים להשיג ביטוי טרנסגנים חזק ועמיד ללא אינטגרציה במגוון רחב של סוגי רקמות, מה שהופך אותם לבחירה פופולרית להעברת גנים במודלים של בעלי חיים ובמסגרות קליניות. בנוסף ליישומים טיפוליים, rAAVs הם כלי מעבדה שימושי להעברת טרנסגנים המותאמים לצרכי הניסוי של החוקר ולמטרות המדעיות שלו בתאים בתרבית. כמה דוגמאות כוללות גנים אקסוגניים של כתבים, קלטות ביטוי יתר, הפרעות RNA וכלים מבוססי קריספר, כולל אלה עבור מסכים ברחבי הגנום. התמרה rAAV פחות מזיקה לתאים מאשר אלקטרופורציה או הדבקה כימית ואינה דורשת ציוד מיוחד או ריאגנטים יקרים כדי לייצר. ניתן להוסיף ליזטים גולמיים או מדיה מותנית המכילה rAAV ישירות לתאים בתרבית ללא טיהור נוסף כדי להתמיר סוגי תאים רבים – תכונה שאינה מוערכת מספיק של rAAVs. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לשיבוט קלטות טרנסגנים בסיסיות ומדגימים כיצד לייצר וליישם תכשירי rAAV גולמיים על תאים בתרבית. כהוכחה עקרונית, אנו מדגימים התמרה של שלושה סוגי תאים שעדיין לא דווחו ביישומי rAAV: תאי שליה, מיובלסטים ואורגנואידים של המעי הדק. אנו דנים בשימושים מתאימים לתכשירי rAAV גולמיים, במגבלות של rAAV להעברת גנים, ובשיקולים לבחירת קפסיד. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, זולה ויעילה עבור חוקרים להשגת העברת DNA פרודוקטיבית בתרבית תאים באמצעות rAAV ללא צורך בשלבי טיטרציה וטיהור מייגעים.

Elucidating the molecular bases of cellular functions often requires the expression of transgenic DNA in cell culture. To be expressed, transgenes must penetrate through a cell&#39;s selective membrane and reach the nucleus1,2. Therefore, the ability to effectively bypass the cell&#39;s physical barriers and manipulate its central processes is a necessity for applying transgenesis to uncover new biological phenomena. One approach capitalizes on the intrinsic ability of viruses to deliver and express foreign DNA3,4.
Adeno-associated virus (AAV) is one of the smallest mammalian viruses: its 4.7 kilobase (kb), single-stranded DNA genome contains two genes, rep (for replicase) and cap (for capsid), packaged inside of a 60-mer icosahedral capsid measuring 25 nm. The rep/cap genes have multiple promoters, reading frames, and splice products which encode at least nine unique proteins required for viral replication, production, and packaging5,6. Additionally, both ends of the genome contain secondary structures called inverted terminal repeats (ITRs) that are necessary for DNA replication, genome packaging, and downstream processing during transduction7,8,9,10. The ITRs are the only DNA elements that are required for the packaging of the genome into the capsid, and therefore AAV can be cloned for transgene delivery purposes by replacing the viral rep/cap genes with a researcher&#39;s choice of regulatory elements and/or genes of interest6. The resulting recombinant AAV (rAAV), with an engineered vector genome (VG), is widely used in the clinic for human gene therapy and has amassed successes11. An underappreciated use of the vector is in the laboratory; rAAVs can efficiently achieve transgene expression in cultured cells to fulfill a researcher&#39;s experimental needs12.
The most common method for producing rAAV is by triple-plasmid transfection into HEK293 or 293T cells (Figure 1). The first plasmid, commonly called the cis&#160;plasmid, contains the desired transgene flanked by ITRs (pAAV). Depending on the application, cis plasmids with common elements, such as strong promoters or CRISPR-based tools, are available for purchase. The second is the pRep/Cap plasmid that contains the wild-type AAV rep and cap genes provided in-trans&#8212;i.e., on a separate, non-ITR containing plasmid that expresses regulatory and structural elements that then interact with the cis plasmid&#8212;and is thus called the trans plasmid. In addition to physically enclosing&#160;the VG, the capsid influences cellular tropism12,13. By providing the serotype-specific cap gene in-trans, researchers are easily able to maximize transduction efficiency by choosing an optimized capsid serotype for their given target cell. Lastly, as a Dependoparvovirus, AAV requires a helper virus to activate rep/cap expression from its viral promoters, achieved by adenoviral helper genes, provided on a third plasmid such as pAd&#916;F614,15. After 72 h of triple-plasmid transfection, the vector can be released from producer cells into the culture media by repeated freeze/thaw cycles. The entire plate contents are then collected, and large cellular debris is removed by centrifugation; the resulting media supernatant is a crude rAAV preparation ready for downstream transductions.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Overview of crude rAAV vector production. Crude rAAV production and transduction can be accomplished within 5 days. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
rAAV may be more favorable for transgene delivery compared to other transfection methods, which are commonly associated with cellular toxicity, low efficiency, and expensive reagents and equipment, such as for electroporation or chemical/lipid-based transfection16,17. rAAV bypasses these obstacles and often provides potent transgene expression with minimal toxicity, and minimal hands-on time. Importantly, producing rAAV and applying it in cell culture is simple and rarely requires purification of the vector from the culture media (Figure 1). Additionally, rAAV does not integrate its VG into the host genome, unlike Lentiviral transgene delivery, and thus lowers the risk of insertional mutagenesis18. Despite the potential benefits of using rAAV for transgene delivery, limitations must be considered. Importantly, the size of the transgene, including the ITRs, should not exceed 4.9 kb due to physical constraints of the capsid, thereby limiting a researcher&#39;s ability to effectively deliver large regulatory elements and transgenes. Furthermore, since rAAV is a non-integrating virus, transduction results in transient transgene expression in dividing cells and may not be practical for stable expression. However, methods using dual rAAV-delivered Cas9 and homology-directed repair (HDR) templates may be used to stably insert sequences at specific genomic loci if a researcher wishes19.

מחבר זרקור: חשיפת הפוטנציאל של AAV רקומביננטי לא מטוהר במחקר תרביות תאים 

ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו

Gene therapy uses a viral capsid to introduce DNA into cells, and then the cells process that DNA through mechanisms that aren't fully understood. By studying how the cell processes AAV delivered DNA, we hope to improve safety, efficacy and longevity of AAV gene therapies. Studying AAV DNA processing at the tissue or organism level was quite difficult.And while we were developing cell culture transduction protocols for AAV visualization via super resolution microscopy, we found that the simplicity of producing and using unpurified AAV preparations in cell culture is not well known. This straightforward method for transient expression can be advantageous for researchers in numerous fields. Creating crude AAV preparations is quite simple, and they have a long shelf life F4C, allowing them to be used in numerous experiments.Applying them is simple, making them a time and cost-effective alternative to standard transfection reagents. Often AAV crude preparations are more efficient and less toxic than transfection. Vectrology has two arms, production and transduction, and both are entirely dependent on host cellular machinery.Our future research aims to identify the cellular machinery involved in these processes and ways to manipulate them so that we can improve production and transduction efficiency. Understanding the basic biology underpinning both arms of vectrology is vital for the success of gene therapies.

מציאת קפסיד אופטימלי להמרת תאים מתורבתים בעלי עניין מגוון סוגי תאים הומרו כדי לקבוע את הטרופיזם של סרוטיפים שונים של קפסיד (איור 5). הסרוטיפים הטבעיים AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24, וגרסאות הקפסיד המהונדסות Anc80 25, DJ 26, LK0327 ו-KP1 28 נארזו עם גנום וקטורי המבטא mScarlet תחת מקדם CMV, ששובט בשיטות המפורטות בפרוטוקול זה. תכשירי וקטור גולמי ללא טיטציה דוללו באמצעי התרבית המתאימים, ותאים הומרו במשך 24+ שעות וצולמו (איור 5B). יעילות ההתמרה חושבה על ידי החלק היחסי של סך התאים שהיו mScarlet+, או שיעור התאים במישור z יחיד שהיו mScarlet+ (עבור אורגנואידים של עכבר במעי הדק; איור 5C). יעילות התמרה (תאי mScarlet+) אינה מסופקת עבור צינוריות מיו-צינוריות C2C12 ו-HSkMC ממוינות, אלא עבור מיובלסטים C2C12 ו-HSkMC לא ממוינים (איור 5A).
AAV2 ו-KP1 היו הסרוטיפים החזקים ביותר בקווי תאים שנבדקו (איור 5A). כמו כן נצפה כי סוגי תאים דומים שמקורם במינים שונים מומרים ביעילות משתנה. לדוגמה, Hepa1-6 (קו תאי כבד שמקורו במורין) מציג ירידה ניכרת בהתמרה בהשוואה ל-Huh7 (קו תאי כבד שמקורו בבני אדם) בעת שימוש ב-AAV2 (איור 5B). יתר על כן, תנאי מדיה שונים ממלאים תפקיד חשוב במהלך ההעברה. אורגנואידים של עכברים במעי דק (mSIOs) שגודלו בתרבית במצע קדם-טרנסדוקציה עוברים פחות טרנסדוקציה בהשוואה לאלה שגודלו בתרבית במצעי גדילה אורגנואידים (איור 5C). נוסף על כך, AAV2 מתמיר ביעילות מיובלסטים לא ממוינים של HSkMC ומיובלסטים של HSkMC ממוינים (איור 5B), אף על פי שניתוח כמותי של מיו-צינוריות הוא קשה ולכן אינו מסופק.
יעילות ההתמרה הגבוהה שנצפתה עבור סוגי תאים שונים באיור 5 מראה שניתן להשתמש בתכשירים וקטוריים גולמיים ביעילות כדי להתמיר מגוון סוגי תאים ללא שלבים נוספים כגון טיהור וטיטרציה. עם זאת, יש לשקול היטב בעת בחירת קפסיד כדי למקסם את העברת הטרנסגנים. קווי תאים וקפסידים רבים אחרים נבדקו בעבר ומתפרסמים, אם כי עם תכשירים וקטוריים מטוהרים12.
השפעה בלתי תלויה של חלקיק וקטורי בתנאי מדיה יכולה להשפיע על יעילות הטרנסדוקציה. עם זאת, מקובל כי טרופיזם (כלומר, ספיגה ספציפית לסוג התא וביטוי של וקטור) הוא תכונה שהיא ספציפית לקפסיד29. השוואה בין תכשירים גולמיים ומטוהרים התואמים למינון עדיין לא נצפתה כמשפיעה על הטרופיזם התאי. לכן, ניתן להשתמש בתכשירים וקטוריים גולמיים באופן דומה לווקטורים מטוהרים בתרבית תאים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig05.jpg"> איור 5: התמרה וקטורית גולמית של סוגי תאים שונים. (A) אחוז mScarlet+ לאחר הוספה של וקטורי AAV שונים המכילים טרנסגן mScarlet . (B) תאים המבטאים mScarlet המועברים מסרוטיפ AAV 2. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר (Hepa1-6, Huh7, C2C12 ו-HSkMC), 200 מיקרומטר (BeWo), 20 מיקרומטר (mSIO). קיצורים: hpt = שעות לאחר ההעברה. (C) אורגנואידים של עכברים במעי דק (mSIOs) טופלו ב-rAAV במצע קדם-התמרה או במצע גדילה אורגנואידי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: דף עבודה של טרנספקציה פלסמיד משולש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/TriplePlasmidTransfection_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 2: גליון עבודה לאופטימיזציה של PEI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/PEIoptimization_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Potential of Unpurified Recombinant AAVs in Cell Culture Research at JoVE.com

וירוס רקומביננטי הקשור באדנו (rAAV) נמצא בשימוש נרחב להעברת גנים קליניים ופרה-קליניים. שימוש לא מוערך מספיק עבור rAAVs הוא התמרה חזקה של תאים בתרבית ללא צורך בטיהור. עבור חוקרים חדשים ב-rAAV, אנו מספקים פרוטוקול לשיבוט קלטות טרנסגניות, ייצור וקטורים גולמיים והתמרה של תרביות תאים.

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

ריפוי גנטי משתמש בקפסיד נגיפי כדי להחדיר דנ"א לתאים, ואז התאים מעבדים את הדנ"א הזה באמצעות מנגנונים שאינם מובנים במלואם. על ידי חקר האופן שבו התא מעבד AAV מספק DNA, אנו מקווים לשפר את הבטיחות, היעילות ואריכות הימים של טיפולים גנטיים AAV. חקר עיבוד דנ"א AAV ברמת הרקמה או האורגניזם היה די קשה.ובזמן שפיתחנו פרוטוקולים להתמרה של תרביות תאים עבור הדמיה של AAV באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציית על, גילינו שהפשטות של ייצור ושימוש בתכשירי AAV לא מטוהרים בתרבית תאים אינה ידועה. שיטה פשוטה זו לביטוי ארעי יכולה להועיל לחוקרים בתחומים רבים. יצירת תכשירי AAV גולמיים היא די פשוטה, ויש להם חיי מדף ארוכים F4C, המאפשר להם לשמש בניסויים רבים.החלתם היא פשוטה, מה שהופך אותם לחלופה זמן וחסכונית לריאגנטים טרנספקציה סטנדרטיים. לעתים קרובות תכשירים גולמיים AAV יעילים יותר ורעילים פחות מאשר טרנספקציה. לווקטרולוגיה יש שתי זרועות, ייצור והתמירה, ושתיהן תלויות לחלוטין במנגנון התאי המארח.המחקר העתידי שלנו נועד לזהות את המנגנונים התאיים המעורבים בתהליכים אלה ודרכים לתמרן אותם כדי שנוכל לשפר את יעילות הייצור וההולכה. הבנת הביולוגיה הבסיסית העומדת בבסיס שתי זרועות הווקטרולוגיה חיונית להצלחת הטיפולים הגנטיים.

transgene-expression-cultured-cells-using-unpurified-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

1.9K Views.  University of California, Berkeley. ריפוי גנטי משתמש בקפסיד נגיפי כדי להחדיר דנ"א לתאים, ואז התאים מעבדים את הדנ"א הזה באמצעות מנגנונים שאינם מובנים במלואם. על ידי חקר האופן שבו התא מעבד AAV מספק DNA, אנו מקווים לשפר את הבטיחות, היעילות ואריכות הימים של טיפולים גנטיים AAV. חקר עיבוד דנ"א AAV ברמת הרקמה או האורגניזם הי?...

Video: מחבר זרקור: חשיפת הפוטנציאל של AAV רקומביננטי לא מטוהר במחקר תרביות תאים 

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue types, making them a popular choice for gene delivery in animal models and in clinical settings. In addition to therapeutic applications, rAAVs are a useful laboratory tool for delivering transgenes tailored to the researcher&#39;s experimental needs and scientific goals in cultured cells. Some examples include exogenous reporter genes, overexpression cassettes, RNA interference, and CRISPR-based tools, including those for genome-wide screens. rAAV transductions are less harmful to cells than electroporation or chemical transfection and do not require any special equipment or expensive reagents to produce. Crude lysates or conditioned media containing rAAVs can be added directly to cultured cells without further purification to transduce many cell types&#8212;an underappreciated feature of rAAVs. Here, we provide protocols for basic transgene cassette cloning and demonstrate how to produce and apply crude rAAV preparations to cultured cells. As proof of principle, we demonstrate the transduction of three cell types that have not yet been reported in rAAV applications: placental cells, myoblasts, and small intestinal organoids. We discuss appropriate uses for crude rAAV preparations, the limitations of rAAVs for gene delivery, and considerations for capsid choice. This protocol outlines a simple, low-cost, and effective method for researchers to achieve productive DNA delivery in cell culture using rAAV without the need for laborious titration and purification steps.

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is widely used for clinical and preclinical gene delivery. An underappreciated use for rAAVs is the robust transduction of cultured cells without the need for purification. For researchers new to rAAV, we provide a protocol for transgene cassette cloning, crude vector production, and cell culture transduction.

Production of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors and Transduction of Cultured Cells

After cloning the gene of interest in adeno-associated ITR containing plasmid, seed three times 10 to the fifth cells into a six-well plate using pre-warmed DMEM supplemented with 10%FBS. Allow the cells to grow at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide to attain 75 to 90%confluence. Next, dissolve 100 milligrams of polyethylenimine hydrochloride or PEI max in 100 milliliters of distilled water to make one microgram per microliter stock.Adjust the pH to 7.1 using sodium hydroxide. Then sterilize the mixture using a 0.22 micrometer filter and store the reagent for one month at four degrees Celsius. In a two milliliter tube, add 1.3 microgram rep/cap plasmid, 1.3 microgram ITR containing plasmid, and 2.6 microgram adenovirus helper plasmid to serum free DMEM.The total volume of this mixture should be 100 microliters. Prepare a negative control in a separate tube, replacing rep/cap plasmid with an unrelated plasmid. Now add 5.2 microliters of PEI max to the plasmid mixture.This maintains an equal plasmid to PEI ratio. Gently vortex 10 to 15 times on a vortex mixer set to seven. For multiple vectors, stagger the PEI addition at one minute intervals for sufficient time in subsequent steps.Incubate each tube for exactly 15 minutes at room temperature. Then dilute the reaction by adding 1.9 milliliters of serum free DMEM to achieve a final volume of two milliliters. Gently pipette twice to mix contents.Aspirate media from the well. Carefully add the plasmid PEI mixture to the sides of the well to avoid cell detachment and incubate cells for 72 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Then freeze the plate of transfected cells for 30 minutes at minus 80 degrees Celsius and thaw for 30 minutes at 37 degrees Celsius.Repeat the cycle a total of three times. In a laminar flow hood, aseptically mix each well by pipetting to disrupt cells effectively. Transfer the lysate to a two milliliter tube.Centrifuge at 15, 000 G for 15 minutes at room temperature to remove cell debris and carefully transfer the supernatant to a new two milliliter tube and store the tube at four degrees Celsius. Next, plate the desired cell type in a 96-well plate and incubate for a target confluency of 50 to 75%depending on the transduction duration. The following day, perform a one-to-three dilution series of the crude preparation in serum free media to obtain the optimal amount of vector required for transduction.Then aspirate the media from the 96-well plate and add 50 to 100 microliters of diluted crude preparation to the wells. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. To determine the transduction efficiency, observe the expression of the fluorescent reporter using a fluorescent microscope at 48 hours post-transduction.For further analysis, remove the vector and wash cells once with pre-warmed PBS. Finally, terminate transduction by fixing cells in 4%paraformaldehyde for 10 minutes. Transduction efficiency data suggested AAV2 and KP1 were the most potent serotypes across all the tested cell lines.HEPA1-6 exhibited a marked decrease in transduction compared to Huh7. AAV2 efficiently transduced undifferentiated HSKMC myoblasts and differentiated HSKMC myotubes. Different media conditions play an important role during transduction.Mouse small intestinal organoids cultured in pre-transduction media were less effectively transduced compared to those cultured in organoid growth media.