מחקר זה נתמך על ידי פרויקט החדשנות המדעית והטכנולוגית הגדול (2020CXGC010802).

הערה: שימו לב למדידות בטיחות לפני לכידת חרקים נודדים מסוג בר, מומלץ ללבוש ציוד בטיחות (כפפות, חולצות עם שרוולים ארוכים ומשקפי מגן). כמו כן, כבו את המלכודת כאשר אינה בשימוש כדי למנוע סכנות בטיחות אחרות וחימום יתר של האור. חשוב לעקוב אחר פרוטוקולי בטיחות לפני נתיחה, כגון לבישת כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה כדי למנוע חשיפה לנוזלי גוף וכימיקלים.
1. לכידת חרקים נודדים
<ol><li>התחל פרוטוקול זה על ידי לכידת חרקים באמצעות מנורת הזרקור. בפרוטוקול זה, מקור חרק הבדיקה הוא מחוז ג'יאנג, העיר ג'ינאן, מחוז שאנדונג, סין (36.977088° N, 116.982747° E).</li>
	<li>השתמש בגוף הראשי של מנורת הזרקור, העשויה פלדה לא חלודה, בתיבה, שהיא גוף מלבני, ובפנס הלוגן מסוג GT75, בהספק של 1000 W. מקם את הפנס הקדמי באמצע כמקור האור.</li>
	<li>הניחו תעלת איסוף חרקים בצורת משפך בתוך האור ובתחתיתו, הניחו קופסה לאיסוף חרקים בקוטר של 5 ס"מ, ואחריה שקית רשת לאיסוף חרקים בת 60 מסדר (0.5 מ' על 0.5 מ'), המשמשת לאיסוף חרקים לכודים באור. הקרנת האור הידועה היא בגובה של כ-500 מ' מעל פני הקרקע.</li>
	<li>פרוטוקול זה מדגיש את דינמיקת הנדידה של נקבות פראיות והתפתחות השחלות; לכן, לאסוף מינים שונים של חרקים (כאן האיסוף נעשה מאפריל עד אוגוסט, במהלך 2021 עד 2022). הימנעו מאיסוף חרקים קטנים ופצועים, בחרו מזיקים גדולים בגודל דומה לניסוי זה.</li>
</ol>2. הכנת חרקים
<ol><li>מעבירים את כל החרקים שנאספו משקית הרשת (0.5 מ') לכלוב הרשת (30X30 ס"מ), ולאחר מכן מספקים צלחת פטרי המכילה תמיסה מעוקרת של 10% מי דבש (האכלה היא אופציונלית). מניחים את הכלוב על 27 ± 2 מעלות צלזיוס, 65% ± 12% לחות יחסית, ולשמור בחושך במשך 8-12 שעות.</li>
	<li>בחרו נקבות בר שעפו בתוך הכלוב באותו היום, העבירו אותן בזהירות לצינורות הבקבוקון הבודדים, וסגרו כל צינור עם מכסה כותנה. הימנעו מטיפול ישיר, שעלול לפגוע או לפצוע את המזיק עקב לחץ מוגזם. הערה: כל נקבות הבר נלכדו בשעות הלילה והנתיחה בוצעה בשעות היום. לפיכך, כל ניסוי בוצע בתוך יום.</li>
</ol>3. הכנה לשיטה לשיתוק חרקים (איור 1)
<ol><li>הכניסו נקבת מזיק נבחרת בנפרד לתוך צינור בקבוקון זבוב באמצע והרדימו את הנקבה באמצעות גזCO2 על ידי החזקת מחט אקדח נשיפה כדי לגרום לשיתוק קל. כדי לוודא אם המזיק משותק או לא, דחפו בעדינות או געו במזיק באמצעות מברשת רכה. אין תגובה לגירויים רכים וחוסר תנועה המעידה על שיתוק מוצלח. הערה: טמפרטורה נמוכה (-20 °C) יכולה לשמש גם כטכניקה חלופית לשיתוק חרקים.</li>
</ol>4. נתיחת חרקים
<ol><li>הכניסו נקבה משותקת טרייה לצלחת פטרי מנותחת המכילה אתנול מוחלט (10 מ"ל). כדי למנוע את ההשפעה של שערות קשקשים אבקת כנפיים במהלך דיסקציה, לחדור את החרק החי או משותק עם אלכוהול מוחלט לשטוף במים נקיים.</li>
	<li>מפרידים את הכנפיים הגביות מצומת גוף החזה והבטן, באמצעות שני זוגות מלקחיים.</li>
	<li>מעבירים את הבטן לצלחת פטרי חד פעמית חדשה, המכילה כמות מתאימה של מים (2-5 מ"מ עומק), ומקלפים בעדינות את השלד החיצוני של הבטן לאורך קו הגחון הגבי מהפה המחודד אל הזנב, באמצעות מלקחיים מנתחים. חזור על אותם צעדים בצד השני, ולאחר מכן לשים אותו במים נקיים כדי לפזר את הרקמות שלמות.</li>
	<li>בזהירות לקלף את רקמות שומן האפידרמיס באמצעות מלקחיים, בעדינות למשוך ולשחרר את השחלות.</li>
	<li>השתמש במלקחיים מנתחים כדי להסיר בעדינות חלקיקי שומן ואיברים אחרים סביב השחלות. בדרך כלל, השחלות המזיקות מקופלות לרוב פנימה משני צידי הבטן, מנסות לפעול בסביבה נוזלית תוך כדי פתיחת השחלות, ולאט לאט מקלפות את שק ההזדווגות מהאמצע, ולקלוט את חלקיקי השומן המחוברים לצינורות השחלות.</li>
	<li>אחזו בעדינות בשחלה ובשק ההזדווגות מהקצה האחורי האנכי ופרשו אותו בזהירות כלפי מטה. כדי למנוע נזק במהלך הפתיחה, להעביר את השחלה לתוך צלחת פטרי חדשה או נקייה המכילה מים. להחזיק את קצה השחלה ולפרוש את השחלה פנימה; בזהירות לבצע שלב זה כדי למנוע נזק של השחלות.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים לאנטומיה של רקמות השחלות
<ol><li>בשלב זה להעריך את התפתחות הביצים עבור כל חרק, בעקבות צבע וגודל הביצים, כדי לשפוט את בגרותו. לאחר מכן, לשפוט את ציון השחלות על פי התפתחות הביצית. הערה: החלוקה של רמות התפתחות השחלות השונות מחולקת בעיקר, או לפני הטלת ביצים או התפתחות ביצית עם רמת משקעים חלמון. התפתחות גרגרי הביצה של חרקים מחולקת עוד יותר לשלבים לבהירות רבה יותר כגון, שלב התרחשות החלמון, שלב הבשלות החלמון ושלב מות החלמון. הבשלות של גרגרי הביצה תלויה במלאות, בצבע ובגודל של הביצה כדי לשפוט את בגרותה.</li>
	<li>לאחר הנתיחה, הקפידו להפריד את רקמות שקי ההזדווגות של הנקבה מהשחלות השלמות, והתבוננו במורפולוגיה כדי להבדיל בין המינים, מכיוון שרוב האנטומיה של שקי ההזדווגות משתנה ממין למין. לכן, השתמשו בשקי הזדווגות כדי להבחין בין מינים.</li>
	<li>בשלב זה, להעריך את האנטומיה השחלות, ולנתח את דירוג התפתחות השחלות. מחלקים את רקמות השחלות לחמש כיתות (כיתה 1 עד כיתה 5).<ol><li>חפשו את השינויים והמבנה הבאים כדי לארגן את הרקמה: כיתה א' (1) היא שלב מוקדם בהתפתחות (חלבי שקוף), בטן מלאה, רכה, שמנה גוף רכה, צבע בהיר, קשה לקלף. דרגה ב' (2) הוא שלב שקיעת החלמון ומדרגים את השחלות בנפרד במידת הצורך לאחר התבוננות בתעלת השחלות הארוכה והעבה יותר. בכיתה ג' (3) יש פחות גופי שומן ורק כמה גרגירים מחוברים לשחלה. כיתה ד' (4) נראית פחות אלסטית וקלה לשבירה, וחלק מהביציות יכולות להימצא באמצע צינור הרחם. כיתה ה '(5) קל לזהות עם פחות או ללא גוף שומן, שחלות אטרופיות ושבריריות.</li>
	</ol></li>
	<li>צלם תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית לפי צורך ניסיוני.</li>
</ol>

דיסקציה לזיהוי חרקים נודדים באמצעות בדיקת רבייה שחלתית

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

שיטות ניתוח שחלות משמשות באופן שגרתי להגנת הצומח, כדי להבהיר את תנועת מעוף החרקים ואוכלוסיית החרקים לחיזוי 19,20,21 ולפרט את השינויים הפיזיולוגיים בחרקים. הבחינו כי יכולת הנדידה הייחודית ויכולת הפיזור המהירה של מזיקים חקלאיים נפוצים, כגון ?...

נדידת חרקים ממלאת תפקיד חיוני בדינמיקת האוכלוסייה של תפוצת חרקים עולמית לחרקים כמו Helicoverpa armigera - תולעת הכותנה, Mythimna נפרדת - תולעת הצבא המזרחית, Spodoptera litura - זחל הטארו, Spodoptera exigua - תולעת צבא הסלק, שדווחו כמזיקים חמורים בסין 1,2,3,4 . מרחקי הנסיעה הארוכים, התנועות העונתיות, ריבוי גבוה של מזיקים נודדים וגורמים אקולוגיים הביאו לקשיים רבים בניבוי, חיזוי והדברה של מזיקים אלה5. ניטור נדידת מזיקים נדרש כדי לחשוף את יכולת ההסתגלות והשינויים ההתנהגותיים המאפשרים מזיקים נודדים בהתאם לשינויי אקלים או מחזורים6. כדי לשמור על גדילתם, התרבותם והישרדותם, חרקים רכשו יכולת הסתגלות רציפה במהלך האבולוציה; סדרה זו של חיים אדפטיביים יצרה שינויים רבים במערכת הרבייה, כגון אסטרטגיית הגירה המובילה לשליטה על התפתחות השחלות בתהליך הנדידה הארוך.
התפתחות השחלות נפוצה אצל מזיקים נודדים, מה שמשפיע על גדילת האוכלוסייה שלהם7. לכן, התפתחות השחלות היא נושא חם של מחקר מזיקים נודדים במשך זמן רב. סדרה של מחקרים הובילה למספר אינדיקטורים להתפתחות השחלות ואסטרטגיות סיווג. עד כה, מספר שיטות שימשו לניתוח התפתחות השחלות, למשל, Loxostege sticalis - עש האחו - התפתחות השחלה הכוללת את שלב הנוצות הראשוני, תקופת ההשרצה המוקדמת, תקופת ההשרצה וסוף האוביפוזיציה8. יש חוקרים המחלקים את רמות השחלות על בסיס התפתחות צבע החלמון במזיקים לפידופטרניים נודדים, כגון S. exigua - תולעת צבא הסלק, Pseudaletia unipuncta - תולעת הצבא האמיתית, ו- Cnaphalocrocis medinalis- תיקיית עלי האורז וכו '.9,10,11,12 . במחקרים קודמים חולקו רמות ההתפתחות השחלתית של מזיקים, כגון תולעת צמר גפן ורולר עלי אורז, לחמישה שלבים: שלב שקיעת החלמון, שלב הבשלת גרגרי הביצה, ההמתנה הבוגרת ללידה, תקופת שיא ההשרצה ושלב סיום ההשרצה13,14. ההתפתחות השחלתית של בורר התירס האירופי חולקה לשישה שלבים התפתחותיים: שלב שקיעת החלמון, הבשלת הביציות, נטיית טרום ביציות, שלב שיא ההשרצה ושלב ההשרצה הסופית15.
יתר על כן, לחרקים מאותו סוג יש שלבי התפתחות שונים, כגון רמות התפתחות השחלות של Spodoptera frugiperda - תולעת צבא הסתיו - מתחלקות לארבע רמות: שלב שקיעת החלמון, המתנה בוגרת ללידה, שיא אובי-פוזיטיביות, וסיום שלב ההשרצה16. מצד שני, להתפתחות השחלות ב- Spodoptera exigua - עש הסלק - יש חמש רמות: שקוף, ויטלוגנזה, הבשלת ביציות, שחרור ביצים והטלת ביצים מאוחרת17.
מחקרים קודמים יכולים לסווג את ההתפתחות רק מרמות התפתחות שחלות בודדות למרובות באמצעות בשלות צבע של חלמון, ביצית והתפתחות ביצית, אך לא ניתן לבצע סיווג על סמך אנטומיה של מערכת הרבייה. התפתחות שחלה המבוססת על אנטומיה מורפוגנזה היא תחום פחות נחקר. כאן, שיטת הדיסקציה נועדה לחזות נקבות נודדות באוכלוסייה באמצעות שני סוגי רקמת שחלה, כדי לפרט את דינמיקת הרבייה שלהן בהתבסס על המורפוגנזה האנטומית של שלב התפתחות השחלות ושק ההזדווגות - ולספק ראיות ישירות להבחנה בין נקבות בר נודדות.
כמה מחקרים מצאו כי, מיני חרקים נודדים Noctuidae נלכדו לעתים קרובות על ידי זרקורים18. השחלה של רוב מיני החרקים הנודדים Noctuidae נמצאת בשלבי התפתחות מוקדמים בשלב הראשוני של הנדידה ורמת השחלות עולה עם התקדמות הנדידה. במחקר זה מתוארת שיטת הדיסקציה לציוני התפתחות השחלות, כדי לחקור את שתי רקמות הרבייה של מזיקים שונים באוכלוסיית הנשים, שנלכדו באור חיפוש. שיטה זו לא רק מקדמת את המחקר להבנת דינמיקת הנדידה, אלא גם מתקנים בסיווג חרקים, מחקר פיזיולוגיה של חרקים, חיזוי מזיקים וחיזוי מיני מזיקים נקבות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon ( China ) co., LTD</td>
			<td>EOS 800D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropper</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute (99.7%)</td>
			<td>Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>&#160;Vetus Tools co., LTD</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GT75 type halogen headlamp (1000 W)</td>
			<td>Shanghai Yadeng Industry co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua</td>
			<td>Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder, beaker, flask</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Net bag&#160;</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>0.5 m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Net cages&#160;</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>30 cm x 30 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>&#160;60 mm diameter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and grading of ovarian development in wild-type female insects

מזיקים חרקים נודדים מציבים אתגרים רציניים לייצור מזון וביטחון בכל רחבי העולם. ניתן לנטר וללכוד את המזיקים הנודדים באמצעות מלכודות זרקורים. אחת הטכניקות החשובות ביותר לחיזוי מזיקים נודדים היא זיהוי המינים הנודדים. עם זאת, ברוב המקרים, קשה לקבל את המידע רק על ידי המראה. לכן, שימוש בידע שנרכש על ידי ניתוח שיטתי של מערכת הרבייה הנשית יכול לעזור להבין את המורפולוגיה האנטומית המשולבת של שק ההזדווגות השחלתי ודירוג התפתחותי של שחלות של חרקים נודדים מסוג בר שנלכדו במלכודות זרקור. כדי להדגים את הישימות של שיטה זו, מצב התפתחות השחלות ושלבי התפתחות גרגרי הביציות הוערכו ישירות ב- Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura ו - Spodoptera exigua עבור האנטומיה השחלתית, ושקי ההזדווגות השחלתיים נחקרו ב- Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae ו - Spodoptera exiguaלחקור את מערכות היחסים שלהם., עבודה זו מציגה את שיטת הדיסקציה הספציפית לחיזוי חרקים נודדים מסוג בר, תוך השוואת מערכת הרבייה הייחודית של חרקים נודדים שונים. לאחר מכן, שתי הרקמות, כלומר השחלה ושקי ההזדווגות, נחקרו עוד יותר. שיטה זו מסייעת לחזות את הדינמיקה ואת ההתפתחות המבנית של מערכות הרבייה אצל נקבות חרקים נודדים מסוג בר.

Migration of insects plays a vital role in population dynamics of global insect distribution for insects like Helicoverpa armigera - the cotton bollworm, Mythimna separate - the oriental armyworm, Spodoptera litura - the taro caterpillar, Spodoptera exigua - the beet armyworm, that have been reported as serious pests in China1,2,3,4. The long travel distances, seasonal movements, high fecundity of migratory pests, and ecological factors have brought great difficulties in the prediction, forecast, and control of these pests5. Pest migration monitoring is required to reveal the adaptability and behavioral changes that facilitate migratory pests according to climate changes or cycles6. To sustain their growth, reproduction, and survival, insects have acquired sequential adaptability during evolution; this series of adaptive life has generated many changes in the reproductive system, such as migratory strategy leading to control of ovarian development in the long migratory process.
Ovarian development is common in migratory pests, which affects the growth of their population7. Therefore, ovarian development has been a hot topic of migratory pest research for a long time. A series of studies have led to several ovarian development indicators and classification strategies. Until now, several methods have been used to analyze ovary development, e.g., Loxostege sticticalis - the meadow moth- ovary development which includes the initial feathering stage, the early spawning period, the spawning period, and the end of oviposition8. Some researchers divide ovarian levels on the bases of yolk color development in migratory Lepidopteran pests, such as S. exigua - the beet armyworm, Pseudaletia unipuncta - the true armyworm, and Cnaphalocrocis medinalis- the rice leaf-folder, etc.9,10,11,12. In previous studies, the ovarian development levels for pests, such as cotton bollworm and rice leaf roller, were divided into five stages: yolk deposition stage, egg grain maturity stage, mature waiting for birth, peak ovogenesis period, and end spawning stage13,14. The ovarian development of the European corn borer was divided into six developmental stages: yolk deposition stage, egg maturation, pre-eggs dispositioning, peak spawning stage, and end-spawning stage15.
Moreover, insects of the same genus have different stages of development, such as ovarian development levels of Spodoptera frugiperda - the fall armyworm - falls into four levels: yolk deposition stage, mature waiting for delivery, peak ovi-positivity, and end spawning stage16. On the other hand, ovarian development in Spodoptera exigua - the beet moth - has five levels: transparent, vitellogenesis, maturation of eggs, egg release, and late egg-laying levels17.
Former studies can only classify development from single to multiple ovarian development levels using color maturity of yolk, oviposition, and egg developments, but classification cannot be done based on anatomy of the reproductive system. The development of an ovary based on the morphogenesis anatomy is a less studied area. Here, the dissection method was designed to predict migratory females in the population using two ovarian tissue types, to elaborate their reproductive dynamics based on the anatomical morphogenesis of -ovarian development stage and mating sac- providing direct evidence to distinguish migratory wild-type females.
Some studies have found that, migratory Noctuidae insect species were frequently captured by searchlights18. The ovary of most migratory Noctuidae insect species is in the early stages of development during the initial stage of migration and the ovarian level increases with the migratory progress. In this study, the dissection method for ovarian development grades is described, to study the two reproductive tissues of different female population pests, captured by search light. This method not only advances the research to understand the migratory dynamics, but also facilities in insect classification, insect physiology study, pest prediction, and forecasting of female pest species.

מחבר זרקור: ניתוח אנטומיה של השחלות בחרקים נודדים כדי להתגבר על אתגרים ניסיוניים 

דיסקציה ודירוג התפתחות השחלות בנקבות חרקים מסוג בר

We aim to apply easy and this newest method for migratory pest, in describing the ovarian anatomy of migratory females. This information will be useful to analyze similar individual species. To predict migratory female insects is pretty challenging.Therefore, visualization of ovarian anatomy is quite easy and very useful.

התפתחות הביצים הפרוטוקול הנ"ל יושם כדי לנתח את התפתחות הביציות בשחלה. לשם כך, ראשית, הביצים סווגו באופן כללי לארבעה שלבים כדי להבחין בשלב מוקדם ובשל של התפתחות הביצים בין כל המינים, כגון תולעת שור, תולעת צבא, זחל טארו ועש סלק. כאן נצפה השלב המוקדם של הנוצות (שלב שקוף לבן חלבי). <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Ovarian Anatomy in Migratory Insects to Overcome Experimental Challenges at JoVE.com

הפרוטוקול מדגים שיטת דיסקציה פשוטה וקלה, המתאימה לנקבות חרקים נודדות מסוג בר שנלכדו במלכודות זרקור. טכניקה זו יכולה להבהיר באופן משמעותי את אותו מין על ידי השוואת שתי רקמות הרבייה, כלומר שק ההזדווגות והתפתחות השחלות של חרקים נקבות מסוג בר.

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using ...

אנו שואפים ליישם שיטה קלה וחדשה זו עבור מזיקים נודדים, בתיאור האנטומיה השחלתית של נקבות נודדות. מידע זה יהיה שימושי לניתוח מינים בודדים דומים. לחזות נקבות חרקים נודדות זה די מאתגר.לכן, הדמיה של אנטומיה השחלות הוא די קל מאוד שימושי.

dissection-grading-ovarian-development-wild-type-female

Research

JoVE Journal

Behavior

Dissection and Grading of Ovarian Development in Wild-Type Female Insects

967 Views.  Shandong Academy of Agricultural Sciences. אנו שואפים ליישם שיטה קלה וחדשה זו עבור מזיקים נודדים, בתיאור האנטומיה השחלתית של נקבות נודדות. מידע זה יהיה שימושי לניתוח מינים בודדים דומים. לחזות נקבות חרקים נודדות זה די מאתגר.לכן, הדמיה של אנטומיה השחלות הוא די קל מאוד שימושי.

Video: מחבר זרקור: ניתוח אנטומיה של השחלות בחרקים נודדים כדי להתגבר על אתגרים ניסיוניים 

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using searchlight traps. One of the most important techniques for migratory pest forecasting is to identify the migratory species. However, in most cases, it is difficult to get the information just by appearance. Therefore, using knowledge acquired by systematic analysis of the female reproductive system can help to understand the combined anatomic morphology of the ovarian mating sac and ovary developmental grading of wild-type migratory insects captured with searchlight traps. To demonstrate the applicability of this method, ovarian development status and egg grain development stages were directly assessed in Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura, and Spodoptera exigua for the ovarian anatomy, and the ovarian mating sacs were studied in Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae, and Spodoptera exigua, to explore their relationships. This work shows the specific dissection method to predict wild-type migratory insects, comparing the unique reproductive system of different migratory insects. Then, both tissues, namely, the ovary and mating sacs, were further investigated. This method helps to predict the dynamics and the structural development of reproductive systems in wild-type female migratory insects.

The protocol demonstrates a simple and easy dissection method, suitable for wild-type migratory female insects captured with searchlight traps. This technique can significantly clarify the same species by comparing both reproductive tissues, namely the mating sac and ovarian development of wild-type female insects.

Noctuidae Insect Preparation, Dissection, and Ovarian Tissue Analysis

Noctuidae Insect Preparation, Dissection, and Ovarian Tissue Analysis  

Begin by transferring all the collected Noctuidae insects from the net bag to a net cage. Next, provide a Petri dish containing a sterilized 10%honey water solution. Set the cage in a stable environment.Choose wild type female insects that have ventured inside the cage that same day. Carefully transfer these insects into individual vial tubes, ensuring each tube is sealed with a cotton lid. For insect dissection, first place a freshly paralyzed female insect into a dissecting Petri dish containing absolute ethanol.To ensure a clean dissection, infiltrate the insect with absolute alcohol and rinse it in clean water. Next, using forceps, separate the dorsal wings at the junction of the chest and abdomen. Transfer the abdomen into a new disposable dish filled with two to five millimeters of water.Using dissecting forceps, gently peel the abdominal exoskeleton, starting from the pointed mouth dorsoventrally to the tail. Replicate these steps on the other side and place it in clean water to disperse the intact tissues. Now delicately peel off the epidermis fat tissues using forceps and gently pull and release the ovaries.With a pair of dissecting forceps, gently remove fat particles and any surrounding organs from the ovaries. Gradually peel off the mating sac from the middle and eliminate fat particles attached to the ovarian tubes. Gently hold onto the ovary and mating sac from the vertical posterior end, then slowly unfold it downwards.To prevent damage, transfer the ovary into a new or clean Petri dish filled with water. Hold the ovarian tip and unfold the ovary inwardly. Assess the egg maturity for the insect using color and size indicators.Then judge the ovarian grade according to the egg development. After dissection, make sure to separate the female mating sac tissues from the intact ovaries. Examine the morphology as mating sac anatomical features differ from species to species.Next, analyze the ovarian anatomy by dividing the ovarian tissues into five distinct grades. Lastly, capture images of the ovary using a digital camera as per the requirements of the experiment. Four different stages of ovarian development were observed, including the milky white transparent stage with underdeveloped ovaries, the yolk deposition stage with large slightly immature eggs, the ripening stage with bright yellow bead-shaped eggs and the end spawning stage with few or no egg grains.The mating sac of a wild type insect Helicoverpa armigera had a columnar right helix with an inner lumen. Mythimna separata had a G-shaped mating sac with dark brown bands. The mating sac of Agrotis ipsilon was linear with large coils outer back cysts.Spaelotis valida had a slightly brownish thin J-shaped mating sac, while Spodoptera exigua showed a white translucent dumbbell-shaped sac with a bubble cyst in the middle. The mating sac of Spodoptera litura was red with an upper milky white transparent mouth and a faintly visible internal cystic cavity. Pseudoptera lepigone mating sac was small and coiled with closed outer cysts.Mamestra brassicae had olive colored double coiled sacs with outer cysts. Old worm ovarian grading showed transparent and elastic ovarian ducts with grade one visible oocytes. At grade two, the ovarian duct became transparent with tender yellow eggs.At grade three, large fat bodies were absent with the duct being thickest at the ovipositor. Grades four and five showed clusters and fewer eggs in the ovaries with pale yellow and greenish color. All five ovarian grades were also observed in the armyworm, in the tarot caterpillar, and in the bollworm.