Name: dissection and grading of ovarian development in wild-type female insects
Uploaded: 2023-07-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Ovarian Anatomy in Migratory Insects to Overcome Experimental Challenges at JoVE.com

이 연구는 주요 과학 기술 혁신 프로젝트(2020CXGC010802)의 지원을 받았습니다.

알림: 야생형 철새를 잡기 전에 안전 측정에 주의하고 안전 장비(장갑, 긴팔 셔츠, 고글)를 착용하는 것이 좋습니다. 또한 다른 안전 위험 및 조명 과열을 방지하기 위해 사용하지 않을 때는 트랩을 끄십시오. 체액 및 화학 물질에 대한 노출을 방지하기 위해 장갑, 고글, 실험실 가운을 착용하는 것과 같은 해부 전에 안전 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다.
1. 철새의 포획
<ol><li>탐조등 램프를 사용하여 곤충을 포획하여 이 프로토콜을 시작합니다. 이 프로토콜에서 테스트 곤충 출처는 중국 산둥성 지난시 지양구(북위 36.977088°, 동경 116.982747°)입니다.</li>
	<li>녹슬지 않은 강철로 만들어진 탐조등 램프의 본체, 직사각형 몸체인 상자, 1000W의 출력을 가진 GT75형 할로겐 헤드램프를 사용합니다.</li>
	<li>깔때기 모양의 곤충 수집 채널을 조명 내부와 바닥에 놓고 직경 5cm의 곤충 수집 상자를 놓고 빛에 갇힌 곤충을 수집하는 데 사용되는 60개의 곤충 수집 그물 가방(0.5m x 0.5m)을 놓습니다. 알려진 빛의 투영은 지상에서 약 500m입니다.</li>
	<li>이 프로토콜은 야생형 암컷의 이주 역학과 난소 발달을 강조합니다. 따라서 다양한 종의 곤충을 수집하십시오(여기서는 2021년부터 2022년까지 4월부터 8월까지 수집했습니다). 크기가 작고 다친 곤충을 수집하지 말고 이 실험을 위해 비슷한 크기의 큰 해충을 선택하십시오.</li>
</ol>2. 곤충의 준비
<ol><li>수집된 모든 곤충을 그물 주머니(0.5m)에서 그물 케이지(30cm x 30cm)로 옮긴 다음 10% 꿀물의 살균 용액이 포함된 페트리 접시를 제공합니다(먹이는 선택 사항). 케이지를 27 ± 2°C, 65% ± 12% 상대 습도에 놓고 8-12시간 동안 어두운 곳에 보관합니다.</li>
	<li>같은 날 케이지 내부로 날아간 야생형 암컷을 선택하여 개별 바이알 튜브에 조심스럽게 옮기고 면 뚜껑으로 각 튜브를 닫습니다. 과도한 압력으로 인해 해충을 손상시키거나 다치게 할 수 있는 직접적인 취급을 피하십시오. 참고: 모든 야생형 암컷은 야간에 포획되었고 해부는 낮에 수행되었습니다. 따라서 각 실험은 하루 이내에 수행되었습니다.</li>
</ol>3. 곤충 마비 방법의 준비(그림 1)
<ol><li>선택한 암컷 해충을 중간에 있는 플라이 바이알 튜브에 개별적으로 넣고 블로우 건 바늘을 잡고CO2 가스를 사용하여 암컷을 마취하여 경미한 마비를 일으킵니다. 해충이 마비되었는지 여부를 확인하려면 부드러운 브러시를 사용하여 해충을 부드럽게 찌르거나 만집니다. 부드러운 자극과 부동성에 대한 반응이 없으면 마비가 성공했음을 나타냅니다. 알림: 저온(-20°C)은 곤충을 마비시키는 대체 기술로도 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 곤충의 해부
<ol><li>갓 마비된 여성을 절대 에탄올(10mL)이 포함된 해부 페트리 접시에 넣습니다. 해부 중 비늘 털과 날개 가루의 영향을 피하려면 살아있는 곤충이나 마비된 곤충에 절대 알코올을 침투시키고 깨끗한 물로 헹굽니다.</li>
	<li>두 쌍의 집게를 사용하여 가슴과 복부의 접합부에서 등쪽 날개를 분리합니다.</li>
	<li>적절한 양의 물(2-5mm 깊이)이 들어 있는 새로운 일회용 페트리 접시에 복부를 옮기고 해부 집게를 사용하여 뾰족한 입에서 꼬리까지 등쪽 복부 선을 따라 복부 외골격을 부드럽게 벗겨냅니다. 반대쪽도 같은 단계를 반복한 다음 깨끗한 물에 넣어 손상되지 않은 조직을 분산시킵니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 표피 지방 조직을 정중하게 벗겨내고 난소를 부드럽게 당겨 풀어줍니다.</li>
	<li>해부 집게를 사용하여 난소 주변의 지방 입자와 기타 장기를 부드럽게 제거합니다. 일반적으로 해충 난소는 대부분 복부 양쪽에서 안쪽으로 접혀 난소를 펼치면서 액체 환경에서 작동하려고 시도하고 중간에서 교미 주머니를 천천히 벗겨내고 난소관에 붙어있는 지방 입자를 골라냅니다.</li>
	<li>수직 뒤쪽 끝에서 난소와 짝짓기 주머니를 부드럽게 잡고 조심스럽게 아래쪽으로 펼칩니다. 펼치는 동안 손상을 방지하려면 난소를 물이 들어 있는 새 접시 또는 깨끗한 페트리 접시에 옮기십시오. 난소 끝을 잡고 난소를 안쪽으로 펼칩니다. 난소의 손상을 방지하기 위해 이 단계를 조심스럽게 수행하십시오.</li>
</ol>5. 난소 조직 해부학을 위한 데이터 분석
<ol><li>이 단계에서는 알의 색상과 크기에 따라 각 곤충의 알 발달을 평가하여 성숙도를 판단합니다. 그런 다음 난자 발달에 따라 난소 등급을 판단합니다. 참고: 다양한 난소 발달 수준의 구분은 주로 난자를 낳기 전 또는 난황 강수 수준으로 나뉩니다. 곤충의 달걀 알갱이 발달은 난황 발생 단계, 난황 성숙 단계 및 난황 소멸 단계와 같은 보다 명확한 단계로 더 나뉩니다. 달걀 알갱이의 성숙도는 달걀의 충만함, 색, 크기에 따라 성숙도를 판단합니다.</li>
	<li>해부 후 암컷의 짝짓기 주머니 조직을 온전한 난소에서 분리하고 대부분의 짝짓기 주머니 해부학이 종마다 다르기 때문에 형태를 관찰하여 종을 구별합니다. 따라서 짝짓기 주머니를 사용하여 종을 구별하십시오.</li>
	<li>이 단계에서 난소 해부학을 평가하고 난소 발달 등급을 분석합니다. 난소 조직을 5개의 등급(1등급에서 5등급)으로 나눕니다.<ol><li>조직을 구성하기 위해 다음과 같은 변화와 구조를 찾으십시오 : 1 학년 (1)은 발달 초기 단계 (유백색 투명), 전체 복부, 부드럽고 뚱뚱한 몸은 푹신하고 밝은 색이며 껍질을 벗기기 어렵습니다. 2등급(2)은 난황 침착 단계이며 더 길고 두꺼운 난관을 관찰한 후 필요한 경우 난소를 별도로 등급을 매깁니다. 3학년(3)은 뚱뚱한 몸체가 적고 난소에 붙어있는 과립이 몇 개뿐입니다. 4학년(4)은 탄력이 떨어지고 깨지기 쉬우며, 자궁관 중간에 난자가 있을 수 있습니다. 5학년(5)은 뚱뚱하거나 전혀 체지방이 적거나 전혀 없고, 위축되고 연약한 난소를 쉽게 식별할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실험적 필요에 따라 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다.</li>
</ol>

난소 생식 분석을 통한 철새 곤충 식별을 위한 해부

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

난소 분석 방법은 식물 보호에 일상적으로 사용되며, 19,20,21을 예측하기 위해 곤충의 비행 및 개체군의 이동을 설명하고 곤충의 생리적 변화를 자세히 설명합니다. 볼웜, 아미웜, 토란 애벌레, 사탕무 나방과 같은 일반적인 농업 해충의 독특한 이동과 빠른 분산 능력으로 인해 다른 지역에서 예측하기 어려운 것으로 나타났습?...

곤충의 이동은 중국에서 심각한 해충으로 보고된 Helicoverpa armigera - 면화 bollworm, Mythimna separate(동양 아미웜), Spodoptera litura - 토란 애벌레, Spodoptera exigua - 사탕무 아미웜과 같은 곤충의 전 세계 곤충 분포의 개체군 역학에 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4 . 긴 이동 거리, 계절적 이동, 철새 해충의 높은 번식력, 생태학적 요인으로 인해 이러한 해충의 예측, 예측 및 통제에 큰 어려움이 있습니다5. 해충 이동 모니터링은 기후 변화 또는 주기에 따라 철새 해충을 촉진하는 적응성과 행동 변화를 밝히기 위해 필요하다6. 성장, 번식 및 생존을 유지하기 위해 곤충은 진화 과정에서 순차적 적응성을 획득했습니다. 이러한 일련의 적응 생활은 긴 이동 과정에서 난소 발달을 통제하는 이동 전략과 같은 생식 기관에 많은 변화를 일으켰습니다.
난소 발달은 철새 해충에서 흔히 발생하며, 이는 개체군의 성장에 영향을 미친다7. 따라서 난소 발달은 오랫동안 철새 해충 연구의 뜨거운 주제였습니다. 일련의 연구를 통해 여러 난소 발달 지표와 분류 전략이 도출되었습니다. 지금까지는 난소 발달을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었는데, 예를 들어 Loxostege sticticalis - 초원 나방의 난소 발달은 초기 깃털 단계, 초기 산란 기간, 산란 기간 및 산란 종료8을 포함합니다. 일부 연구자들은 S. exigua(사탕무 아미웜), Pseudaletia unipuncta(진정한 아미웜), Cnaphalocrocis medinalis(벼잎 폴더 등)와 같은 철새 나비목 해충의 난황 발색을 기준으로 난황 수준을 나눕니다.9,10,11,12. 선행 연구에서 목화충, 벼잎깍지와 같은 해충의 난소 발달 수준은 난황 침착 단계, 알갱이 성숙 단계, 성숙 출산 대기, 난소 형성 피크 기간, 산란 종료 단계의 5단계로 나뉘었다13,14. 유럽 옥수수 천공충의 난소 발달은 난황 침착 단계, 알 성숙, 알 전 배치, 최대 산란 단계 및 최종 산란 단계15의 6가지 발달 단계로 나뉩니다.
더욱이, 같은 속의 곤충은 난소 발달 단계(가을 아미웜)의 난소 발달 수준과 같이 발달 단계가 다르며, 난황 침착 단계, 성숙한 출산 대기, 최대 난소 양성, 최종 산란 단계16의 네 단계로 나뉩니다. 한편, 사탕무나방인 Spodoptera exigua의 난소 발달은 투명, 유리체 형성, 난자의 성숙, 난자 방출, 늦은 알을 낳는 등의 5단계로 나뉜다.
이전 연구에서는 난황, 산란, 난자 발달의 색 성숙도를 사용하여 단일에서 다발성 난소 발달 수준까지만 분류할 수 있지만 생식계의 해부학적 구조에 따라 분류할 수 없습니다. 형태 형성 해부학에 기초한 난소의 발달은 덜 연구된 영역입니다. 여기서 해부법은 두 가지 난소 조직 유형을 사용하여 개체군에서 이주하는 암컷을 예측하고, 난소 발달 단계와 짝짓기 주머니의 해부학적 형태 기전을 기반으로 생식 역학을 정교화하여 이주하는 야생형 암컷을 구별할 수 있는 직접적인 증거를 제공하도록 설계되었습니다.
일부 연구에 따르면 이동하는 Noctuidae 곤충 종은 탐조등에 의해 자주 포착된다18. 대부분의 철새 Noctuidae 곤충 종의 난소는 이동 초기 단계에서 발달 초기 단계에 있으며 철새 진행에 따라 난소 수준이 증가합니다. 이 연구에서는 서치 라이트로 포착 된 서로 다른 여성 인구 해충의 두 생식 조직을 연구하기 위해 난소 발달 등급에 대한 해부 방법을 설명합니다. 이 방법은 철새 동태를 이해하기 위한 연구를 발전시킬 뿐만 아니라 곤충 분류, 곤충 생리학 연구, 해충 예측, 암컷 해충 종 예측 등의 기능을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Digital camera</td><td>Canon ( China ) co., LTD</td><td>EOS 800D</td><td></td></tr><tr><td>Dropper</td><td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute (99.7%)</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>&amp;nbsp;Vetus Tools co., LTD</td><td>ST-14</td><td></td></tr><tr><td>GT75 type halogen headlamp (1000 W)</td><td>Shanghai Yadeng Industry co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua</td><td>Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinder, beaker, flask</td><td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Net bag&amp;nbsp;</td><td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td><td></td><td>0.5 m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Net cages&amp;nbsp;</td><td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td><td></td><td>30 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td><td></td><td>&amp;nbsp;60 mm diameter</td></tr></tbody></table>

dissection and grading of ovarian development in wild-type female insects

철새 해충은 전 세계의 식량 생산과 안보에 심각한 문제를 제기합니다. 철새 해충은 탐조등 트랩을 사용하여 모니터링하고 포획할 수 있습니다. 철새 해충 예측을 위한 가장 중요한 기술 중 하나는 철새 종을 식별하는 것입니다. 그러나 대부분의 경우 외모만으로는 정보를 얻기 어렵습니다. 따라서 암컷의 생식기관을 체계적으로 분석하여 얻은 지식을 활용하면 탐조등 트랩으로 포획한 야생형 철새의 난소 짝짓기 주머니와 난소 발달 등급의 결합된 해부학적 형태를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 적용 가능성을 입증하기 위해 난소 해부학에 대해 Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura 및 Spodoptera exigua 에서 난소 발달 상태 및 난자 발달 단계를 직접 평가했으며 난소 짝짓기 주머니는 Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae 및 Spodoptera exigua에서 연구했습니다, 그들의 관계를 탐색합니다. 본 연구는 야생형 철새를 예측하기 위한 구체적인 해부방법을 제시하고, 철새에 따른 고유의 생식기관을 비교한다. 그런 다음 두 조직, 즉 난소와 짝짓기 주머니를 추가로 조사했습니다. 이 방법은 야생형 암컷 철새 곤충의 생식 시스템의 역학과 구조적 발달을 예측하는 데 도움이 됩니다.

달걀의 발달 위의 프로토콜은 난소에서 난자의 발달을 분석하기 위해 적용되었습니다. 이를 위해 첫째, 알을 일반적으로 4단계로 분류하여 모든 종(예: 볼웜, 아미웜, 토란 애벌레, 사탕무나방) 중에서 알의 발달 초기 단계와 성숙 단계를 구분하였다. 여기에서 깃털 형성의 초기 단계 (유백색 투명 단계)가 관찰되었습니다. 그림 2A 는 난소가 아직 발달하기 시작...

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저자 스포트라이트: 실험적 과제를 극복하기 위한 철새 곤충의 난소 해부학 분석 

이 프로토콜은 탐조등 트랩으로 포획한 야생형 철새 암컷 곤충에 적합한 간단하고 쉬운 해부 방법을 보여줍니다. 이 기술은 두 생식 조직, 즉 야생형 암컷 곤충의 짝짓기 주머니와 난소 발달을 비교하여 동일한 종을 크게 명확히 할 수 있습니다.

야생형 암컷 곤충의 난소 발달 해부 및 등급

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using ...

우리는 철새 암컷의 난소 해부학을 설명할 때 철새 해충에 대한 쉽고 최신 방법을 적용하는 것을 목표로 합니다. 이 정보는 유사한 개별 종을 분석하는 데 유용합니다. 철새를 찾는 암컷 곤충을 예측하는 것은 꽤 어려운 일이다.따라서 난소 해부학의 시각화는 매우 쉽고 매우 유용합니다.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Dissection and Grading of Ovarian Development in Wild-Type Female Insects

1.3K 조회수.  Shandong Academy of Agricultural Sciences. 우리는 철새 암컷의 난소 해부학을 설명할 때 철새 해충에 대한 쉽고 최신 방법을 적용하는 것을 목표로 합니다. 이 정보는 유사한 개별 종을 분석하는 데 유용합니다. 철새를 찾는 암컷 곤충을 예측하는 것은 꽤 어려운 일이다.따라서 난소 해부학의 시각화는 매우 쉽고 매우 유용합니다.

비디오: 저자 스포트라이트: 실험적 과제를 극복하기 위한 철새 곤충의 난소 해부학 분석 

Dissection of Drosophila Ovaries

Drosophila 난소의 해부

연구

생물학

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

발생학

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental treatments. However, because of their small body size, some structures, such as the oviduct with a diameter of 200-400 &#956;m, have proven to be relatively difficult to study except by immunohistochemistry. Recently, immunohistochemical studies have uncovered more complex differences in oviduct segments than were previously recognized; thus, the oviduct is divided into four functional segments with different ratios of seven distinct epithelial cell types. The different embryological origins and ratios of the epithelial cell types likely make the four functional regions differentially susceptible to disease. For example, precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas arise from the infundibulum in mouse models and from the corresponding fimbrial region in the human fallopian tube. The protocol described here details a method for microdissection to subdivide the oviduct in such a way to yield a sufficient amount and purity of RNA necessary for downstream analysis such as reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing (RNAseq). Also described is a mostly non-enzymatic tissue dissociation method appropriate for flow cytometry or single cell RNAseq analysis of fully differentiated oviductal cells. The methods described will facilitate further research utilizing the murine oviduct in the field of reproduction, fertility, cancer, and immunology.

A method for microdissection of the mouse oviduct that allows collection of the individual segments while maintaining RNA integrity is presented. In addition, non-enzymatic oviductal cell dissociation procedure is described. The methods are appropriate for subsequent gene and protein analysis of the functionally different oviductal segments and dissociated oviductal cells.

뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em&gt; 초파리</em&gt; 난소

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining

Accessibility to germ cells allows the study of germ cell development, meiosis, and recombination. The sexual biotype of the freshwater planarian, Schmidtea mediterranea, is a powerful invertebrate model to study the epigenetic specification of germ cells. Unlike the large number of testis and male germ cells, planarian oocytes are relatively difficult to locate and examine, as there are only two ovaries, each with 5-20 oocytes. Deeper localization within the planarian body and lack of protective epithelial tissues also make it challenging to dissect planarian ovaries directly. 
This protocol uses a brief fixation step to facilitate the localization and dissection of planarian ovaries for downstream analysis to overcome these difficulties. The dissected ovary is compatible for ultrastructural examination by transmission electron microscopy (TEM) and antibody immunostaining. The dissection technique outlined in this protocol also allows for gene perturbation experiments, in which the ovaries are examined under different RNA interference (RNAi) conditions. Direct access to the intact germ cells in the ovary achieved by this protocol will greatly improve the imaging depth and quality and allow cellular and subcellular interrogation of oocyte biology.

<meta charset="utf8"></head><body>초고구조 분석 및 항체 염색을 위한 Planarian 난소 절제

This protocol presents steps taken to dissect ovaries in the freshwater planarians, Schmidtea mediterranea. The dissected ovaries are compatible for antibody immunostaining and ultrastructural analysis with transmission electron microscopy to study the cell biology of the oocytes and somatic cells, providing an imaging depth and quality that were previously inaccessible.

야생형 암컷 곤충의 난소 발달 해부 및 등급

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과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

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