Исследование выполнено при поддержке крупного научно-технологического инновационного проекта (2020CXGC010802).

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на меры безопасности перед отловом мигрирующих насекомых дикого типа, рекомендуется надеть защитное снаряжение (перчатки, рубашки с длинными рукавами и защитные очки). Кроме того, выключайте ловушку, когда она не используется, чтобы избежать других угроз безопасности и перегрева света. Перед вскрытием важно соблюдать протоколы безопасности, такие как ношение перчаток, защитных очков и лабораторного халата, чтобы предотвратить воздействие биологических жидкостей и химических веществ.
1. Отлов мигрирующих насекомых
<ol><li>Начните этот протокол с ловли насекомых с помощью лампы-прожектора. В этом протоколе источником тестового насекомого является район Цзиян, город Цзинань, провинция Шаньдун, Китай (36,977088° с. ш., 116,982747° в. д.).</li>
	<li>Используйте основной корпус прожекторной лампы, изготовленный из нержавеющей стали, коробку, представляющую собой прямоугольный корпус, и галогенную фару типа GT75 мощностью 1000 Вт. Поместите фару посередине в качестве источника света.</li>
	<li>Поместите внутрь воронкообразный канал для сбора насекомых, а в нижней части светильника поместите ящик для сбора насекомых диаметром 5 см, а затем сетчатый мешок для сбора насекомых 60-го порядка (0,5 м х 0,5 м), который используется для сбора насекомых, попавших в ловушку света. Известная проекция света находится на высоте около 500 м над землей.</li>
	<li>В этом протоколе особое внимание уделяется иммиграционной динамике самок дикого типа и развитию завязей; поэтому собирайте разные виды насекомых (здесь сбор проводился с апреля по август, в течение 2021-2022 годов). Избегайте сбора мелких и раненых насекомых, выбирайте для этого эксперимента крупных вредителей одинакового размера.</li>
</ol>2. Подготовка насекомых
<ol><li>Всех собранных насекомых переложить из сетчатого мешка (0,5 м) в сетчатую клетку (30 см х 30 см), а затем поставить чашку Петри, содержащую стерилизованный раствор 10% медовой воды (кормление не обязательно). Поместите клетку при температуре 27 ± 2 °C, относительной влажности воздуха 65% ± 12% и выдержите в темноте в течение 8-12 часов.</li>
	<li>Выберите самок дикого типа, которые залетели в клетку в тот же день, осторожно переложите их в индивидуальные пробирки и закройте каждую пробирку хлопчатобумажной крышкой. Избегайте прямого обращения, которое может повредить или травмировать вредителя из-за чрезмерного давления. ПРИМЕЧАНИЕ: Все самки дикого типа были пойманы в ночное время, а вскрытие проводилось в дневное время. Таким образом, каждый эксперимент проводился в течение суток.</li>
</ol>3. Подготовка к методу паралича насекомых (рисунок 1)
<ol><li>Поместите выбранную самку вредителя по отдельности в пробирку с мухами посередине и обезболивайте самку газом CO2 , держа иглу духового пистолета, чтобы вызвать легкий паралич. Чтобы убедиться, парализован вредитель или нет, осторожно подтолкните или прикоснитесь к вредителю мягкой щеткой. Отсутствие реакции на мягкие раздражители и неподвижность указывают на успешный паралич. ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая температура (-20 °C) также может быть использована в качестве альтернативного метода для паралича насекомых.</li>
</ol>4. Вскрытие насекомых
<ol><li>Поместите только что парализованную самку в препарирующую чашку Петри, содержащую абсолютный этанол (10 мл). Чтобы избежать влияния чешуйчатых волосков и порошка крыльев при вскрытии, пропитайте живое или парализованное насекомое абсолютным спиртом и промойте в чистой воде.</li>
	<li>Отделите спинные крылья от места соединения грудной клетки и брюшного туловища с помощью двух пар щипцов.</li>
	<li>Перенесите брюшную полость в новую одноразовую чашку Петри, содержащую соответствующее количество воды (глубиной 2-5 мм), и аккуратно отклейте брюшной экзоскелет вдоль дорсальной вентральной линии от заостренного рта до хвоста, используя препарирующие щипцы. Повторите те же действия с другой стороны, а затем опустите его в чистую воду, чтобы разогнать неповрежденные ткани.</li>
	<li>Аккуратно снимите жировые ткани эпидермиса с помощью щипцов, а яичники аккуратно потяните и отпустите.</li>
	<li>Используйте рассекающие щипцы, чтобы аккуратно удалить частицы жира и другие органы вокруг яичников. Как правило, яичники вредителей в основном загибаются внутрь с обеих сторон брюшка, пытаются работать в жидкой среде, разворачивая яичники, и медленно отделяют брачный мешок посередине и выковыривают частицы жира, прикрепленные к яичниковым трубам.</li>
	<li>Осторожно возьмитесь за завязь и брачный мешок с вертикального заднего конца и осторожно разверните его вниз. Чтобы избежать повреждений во время раскрытия, перенесите завязь в новую или чистую чашку Петри, содержащую воду. Возьмитесь за кончик яичника и разверните завязь внутрь; Осторожно выполняйте этот шаг, чтобы избежать повреждения яйцеклеток.</li>
</ol>5. Анализ данных по анатомии тканей яичников
<ol><li>На этом этапе оценивают развитие яиц каждого насекомого, следя за цветом и размером яиц, чтобы судить о его зрелости. Затем судите о степени яичника в соответствии с развитием яйцеклетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Деление различных уровней развития яичников в основном разделяется, либо до яйцекладки, либо до развития яиц с уровнем осаждения желтка. Развитие яичного зерна насекомых далее разделено на стадии для большей ясности, такие как стадия появления желтка, стадия зрелости желтка и стадия гибели желтка. Зрелость яичного зерна зависит от полноты, цвета и размера яйца, чтобы судить о его зрелости.</li>
	<li>После вскрытия убедитесь, что отделили ткани брачных мешков самок от неповрежденных яичников и наблюдайте за морфологией, чтобы различать виды, потому что анатомия большинства брачных мешков варьируется от вида к виду. Поэтому используйте брачные мешки, чтобы различать виды.</li>
	<li>На этом этапе оценивается анатомия яичников и анализируется оценка развития яичников. Разделите ткани яичников на пять степеней (от 1 до 5 степени).<ol><li>Обратите внимание на следующие изменения и структуру ткани: первый сорт (1) - ранняя стадия развития (молочно-прозрачный), полный живот, мягкий, жирное тело пушистое, светлого цвета, трудно поддается отслаиванию. Вторая стадия (2) – стадия отложения желтка и, при необходимости, яичники оценивают отдельно после наблюдения за более длинным и толстым каналом яичника. Третья степень (3) имеет меньше жировых тел и всего несколько гранул, прикрепленных к яичнику. Четвертая степень (4) кажется менее эластичной и легко ломается, а некоторые яйцеклетки могут присутствовать в середине маточной трубы. Пятую степень (5) легко выявить с меньшим количеством жировых тел или их отсутствием, атрофированными и хрупкими яичниками.</li>
	</ol></li>
	<li>Съемка изображений с помощью цифровой камеры в соответствии с экспериментальными потребностями.</li>
</ol>

Вскрытие для идентификации мигрирующих насекомых с помощью анализа репродуктивной функции яичников

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Методы анализа яичников обычно используются в защите растений для выяснения движения полета насекомых и популяции для прогнозирования 19,20,21 и уточнения физиологических вариаций у насекомых. Было замечено, что уникальная миграция и сп...

Миграция насекомых играет жизненно важную роль в популяционной динамике глобального распределения насекомых, таких как Helicoverpa armigera - хлопковая совка, Mythimna separate - восточная совка, Spodoptera litura - гусеница таро, Spodoptera exigua - свекловичная совка, которые были зарегистрированы как серьезные вредители в Китае 1,2,3,4 . Большие расстояния перемещения, сезонные перемещения, высокая плодовитость мигрирующих вредных организмов и экологические факторы создают большие трудности в прогнозировании, прогнозировании и борьбе с этими вредителями5. Мониторинг миграции вредителей необходим для выявления приспособляемости и поведенческих изменений, способствующих миграции вредителей в соответствии с изменениями климата или циклами6. Чтобы поддерживать свой рост, размножение и выживание, насекомые в процессе эволюции приобрели последовательную приспособляемость; Эта серия адаптивной жизни породила множество изменений в репродуктивной системе, таких как миграционная стратегия, ведущая к контролю развития яичников в длительном миграционном процессе.
Развитие яичников характерно для мигрирующих вредителей, что сказывается на росте их популяции7. Поэтому развитие яичников уже давно является горячей темой исследований мигрирующих вредителей. Серия исследований привела к нескольким показателям развития яичников и стратегиям классификации. До сих пор для анализа развития завязей использовалось несколько методов, например, Loxostege sticticalis - развитие завязи луговой моли, которое включает начальную стадию оперения, ранний нерестовый период, период нереста и конец яйцекладки8. Некоторые исследователи разделяют уровни яичников на основе развития цвета желтка у мигрирующих чешуекрылых вредителей, таких как S. exigua - свекловичная совка, Pseudaletia unipuncta - настоящая совка, Cnaphalocrocis medinalis - рисовый лист и т.д.9,10,11,12. В предыдущих исследованиях уровни развития яичников у вредителей, таких как хлопковая совка и рисовая листовертка, были разделены на пять стадий: стадия отложения желтка, стадия зрелости зерна яиц, зрелое ожидание рождения, период пикового овогенеза и конечная стадия нереста13,14. Развитие яичников европейского кукурузного мотылька было разделено на шесть стадий развития: стадия отложения желтка, стадия созревания яиц, предварительное размещение яиц, пиковая стадия нереста и конечная стадия15.
Кроме того, насекомые одного и того же рода имеют разные стадии развития, например, уровни развития яичников Spodoptera frugiperda - совки - делятся на четыре уровня: стадия отложения желтка, зрелое ожидание родов, пик яйцеположительности и конечная стадия нереста16. С другой стороны, развитие яичников у Spodoptera exigua - свекловичной моли - имеет пять уровней: прозрачный, вителлогенез, созревание яиц, выпуск яиц и поздняя яйцекладка17.
Предыдущие исследования могли классифицировать развитие яичников только от одного до нескольких уровней развития яичников, используя цветную зрелость желтка, яйцекладку и развитие яйцеклетки, но классификация не может быть сделана на основе анатомии репродуктивной системы. Развитие яичника на основе анатомии морфогенеза является менее изученной областью. В данном случае метод вскрытия был разработан для прогнозирования мигрирующих самок в популяции с использованием двух типов ткани яичников, для уточнения их репродуктивной динамики на основе анатомического морфогенеза стадии развития яичников и брачного мешка, что дает прямые доказательства для различения мигрирующих самок дикого типа.
Некоторые исследования показали, что мигрирующие виды насекомых совок часто попадали в объективы прожекторов18. Завязь большинства мигрирующих видов совок находится на ранних стадиях развития на начальном этапе миграции, и уровень яичников увеличивается по мере миграции. В данной работе описан метод вскрытия степеней развития яичников, для изучения двух репродуктивных тканей разных самок популяции вредителей, пойманных прожекторным светом. Этот метод не только способствует пониманию миграционной динамики, но и помогает классифицировать насекомых, изучать физиологию насекомых, прогнозировать вредителей и самок видов вредителей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon ( China ) co., LTD</td>
			<td>EOS 800D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropper</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute (99.7%)</td>
			<td>Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>&#160;Vetus Tools co., LTD</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GT75 type halogen headlamp (1000 W)</td>
			<td>Shanghai Yadeng Industry co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua</td>
			<td>Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder, beaker, flask</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Net bag&#160;</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>0.5 m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Net cages&#160;</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>30 cm x 30 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>&#160;60 mm diameter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and grading of ovarian development in wild-type female insects

Мигрирующие насекомые-вредители создают серьезные проблемы для производства и безопасности продовольствия во всем мире. За мигрирующими вредителями можно наблюдать и ловить с помощью прожекторных ловушек. Одним из наиболее важных методов прогнозирования мигрирующих вредителей является идентификация мигрирующих видов. Однако в большинстве случаев сложно получить информацию только по внешнему виду. Таким образом, использование знаний, полученных при систематическом анализе женской репродуктивной системы, может помочь понять комбинированную анатомическую морфологию брачного мешка яичника и градацию развития яичников перелетных насекомых дикого типа, пойманных прожекторными ловушками. Чтобы продемонстрировать применимость этого метода, состояние развития яичников и стадии развития яичного зерна были непосредственно оценены у Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura и Spodoptera exigua для анатомии яичников, а брачные мешки яичников были изучены у Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae и Spodoptera exigua, чтобы исследовать их взаимоотношения. В данной работе показан специфический метод препарирования для прогнозирования мигрирующих насекомых дикого типа, сравнивая уникальную репродуктивную систему различных мигрирующих насекомых. Затем были дополнительно исследованы обе ткани, а именно яичник и брачные мешки. Этот метод помогает прогнозировать динамику и структурное развитие репродуктивных систем у самок мигрирующих насекомых дикого типа.

Migration of insects plays a vital role in population dynamics of global insect distribution for insects like Helicoverpa armigera - the cotton bollworm, Mythimna separate - the oriental armyworm, Spodoptera litura - the taro caterpillar, Spodoptera exigua - the beet armyworm, that have been reported as serious pests in China1,2,3,4. The long travel distances, seasonal movements, high fecundity of migratory pests, and ecological factors have brought great difficulties in the prediction, forecast, and control of these pests5. Pest migration monitoring is required to reveal the adaptability and behavioral changes that facilitate migratory pests according to climate changes or cycles6. To sustain their growth, reproduction, and survival, insects have acquired sequential adaptability during evolution; this series of adaptive life has generated many changes in the reproductive system, such as migratory strategy leading to control of ovarian development in the long migratory process.
Ovarian development is common in migratory pests, which affects the growth of their population7. Therefore, ovarian development has been a hot topic of migratory pest research for a long time. A series of studies have led to several ovarian development indicators and classification strategies. Until now, several methods have been used to analyze ovary development, e.g., Loxostege sticticalis - the meadow moth- ovary development which includes the initial feathering stage, the early spawning period, the spawning period, and the end of oviposition8. Some researchers divide ovarian levels on the bases of yolk color development in migratory Lepidopteran pests, such as S. exigua - the beet armyworm, Pseudaletia unipuncta - the true armyworm, and Cnaphalocrocis medinalis- the rice leaf-folder, etc.9,10,11,12. In previous studies, the ovarian development levels for pests, such as cotton bollworm and rice leaf roller, were divided into five stages: yolk deposition stage, egg grain maturity stage, mature waiting for birth, peak ovogenesis period, and end spawning stage13,14. The ovarian development of the European corn borer was divided into six developmental stages: yolk deposition stage, egg maturation, pre-eggs dispositioning, peak spawning stage, and end-spawning stage15.
Moreover, insects of the same genus have different stages of development, such as ovarian development levels of Spodoptera frugiperda - the fall armyworm - falls into four levels: yolk deposition stage, mature waiting for delivery, peak ovi-positivity, and end spawning stage16. On the other hand, ovarian development in Spodoptera exigua - the beet moth - has five levels: transparent, vitellogenesis, maturation of eggs, egg release, and late egg-laying levels17.
Former studies can only classify development from single to multiple ovarian development levels using color maturity of yolk, oviposition, and egg developments, but classification cannot be done based on anatomy of the reproductive system. The development of an ovary based on the morphogenesis anatomy is a less studied area. Here, the dissection method was designed to predict migratory females in the population using two ovarian tissue types, to elaborate their reproductive dynamics based on the anatomical morphogenesis of -ovarian development stage and mating sac- providing direct evidence to distinguish migratory wild-type females.
Some studies have found that, migratory Noctuidae insect species were frequently captured by searchlights18. The ovary of most migratory Noctuidae insect species is in the early stages of development during the initial stage of migration and the ovarian level increases with the migratory progress. In this study, the dissection method for ovarian development grades is described, to study the two reproductive tissues of different female population pests, captured by search light. This method not only advances the research to understand the migratory dynamics, but also facilities in insect classification, insect physiology study, pest prediction, and forecasting of female pest species.

В центре внимания автора: Анализ анатомии яичников у перелетных насекомых для преодоления экспериментальных трудностей 

Рассечение и оценка развития яичников у самок насекомых дикого типа

We aim to apply easy and this newest method for migratory pest, in describing the ovarian anatomy of migratory females. This information will be useful to analyze similar individual species. To predict migratory female insects is pretty challenging.Therefore, visualization of ovarian anatomy is quite easy and very useful.

Развитие яйцеклеток Приведенный выше протокол был применен для анализа развития яйцеклеток в яичнике. С этой целью, во-первых, яйца были разделены на четыре стадии, чтобы различать раннюю и зрелую стадию развития яиц у всех видов, например, коробочного червя, совки, гусеницы т...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Ovarian Anatomy in Migratory Insects to Overcome Experimental Challenges at JoVE.com

Протокол демонстрирует простой и легкий метод вскрытия, подходящий для мигрирующих самок насекомых дикого типа, пойманных прожекторными ловушками. Этот метод позволяет существенно прояснить один и тот же вид путем сравнения обеих репродуктивных тканей, а именно брачного мешка и развития яичников самок насекомых дикого типа.

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using ...

Мы стремимся применить этот простой и новейший метод для мигрирующих вредителей при описании анатомии яичников мигрирующих самок. Эта информация будет полезна для анализа похожих отдельных видов. Предсказать мигрирующих самок насекомых довольно сложно.Поэтому визуализация анатомии яичников достаточно проста и очень полезна.

dissection-grading-ovarian-development-wild-type-female

Research

JoVE Journal

Behavior

Dissection and Grading of Ovarian Development in Wild-Type Female Insects

967 Views.  Shandong Academy of Agricultural Sciences. Мы стремимся применить этот простой и новейший метод для мигрирующих вредителей при описании анатомии яичников мигрирующих самок. Эта информация будет полезна для анализа похожих отдельных видов. Предсказать мигрирующих самок насекомых довольно сложно.Поэтому ви?...

Video: В центре внимания автора: Анализ анатомии яичников у перелетных насекомых для преодоления экспериментальных трудностей 

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using searchlight traps. One of the most important techniques for migratory pest forecasting is to identify the migratory species. However, in most cases, it is difficult to get the information just by appearance. Therefore, using knowledge acquired by systematic analysis of the female reproductive system can help to understand the combined anatomic morphology of the ovarian mating sac and ovary developmental grading of wild-type migratory insects captured with searchlight traps. To demonstrate the applicability of this method, ovarian development status and egg grain development stages were directly assessed in Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura, and Spodoptera exigua for the ovarian anatomy, and the ovarian mating sacs were studied in Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae, and Spodoptera exigua, to explore their relationships. This work shows the specific dissection method to predict wild-type migratory insects, comparing the unique reproductive system of different migratory insects. Then, both tissues, namely, the ovary and mating sacs, were further investigated. This method helps to predict the dynamics and the structural development of reproductive systems in wild-type female migratory insects.

The protocol demonstrates a simple and easy dissection method, suitable for wild-type migratory female insects captured with searchlight traps. This technique can significantly clarify the same species by comparing both reproductive tissues, namely the mating sac and ovarian development of wild-type female insects.

Noctuidae Insect Preparation, Dissection, and Ovarian Tissue Analysis

Подготовка от насекомых Noctuidae, вскрытие и анализ ткани яичников  

Begin by transferring all the collected Noctuidae insects from the net bag to a net cage. Next, provide a Petri dish containing a sterilized 10%honey water solution. Set the cage in a stable environment.Choose wild type female insects that have ventured inside the cage that same day. Carefully transfer these insects into individual vial tubes, ensuring each tube is sealed with a cotton lid. For insect dissection, first place a freshly paralyzed female insect into a dissecting Petri dish containing absolute ethanol.To ensure a clean dissection, infiltrate the insect with absolute alcohol and rinse it in clean water. Next, using forceps, separate the dorsal wings at the junction of the chest and abdomen. Transfer the abdomen into a new disposable dish filled with two to five millimeters of water.Using dissecting forceps, gently peel the abdominal exoskeleton, starting from the pointed mouth dorsoventrally to the tail. Replicate these steps on the other side and place it in clean water to disperse the intact tissues. Now delicately peel off the epidermis fat tissues using forceps and gently pull and release the ovaries.With a pair of dissecting forceps, gently remove fat particles and any surrounding organs from the ovaries. Gradually peel off the mating sac from the middle and eliminate fat particles attached to the ovarian tubes. Gently hold onto the ovary and mating sac from the vertical posterior end, then slowly unfold it downwards.To prevent damage, transfer the ovary into a new or clean Petri dish filled with water. Hold the ovarian tip and unfold the ovary inwardly. Assess the egg maturity for the insect using color and size indicators.Then judge the ovarian grade according to the egg development. After dissection, make sure to separate the female mating sac tissues from the intact ovaries. Examine the morphology as mating sac anatomical features differ from species to species.Next, analyze the ovarian anatomy by dividing the ovarian tissues into five distinct grades. Lastly, capture images of the ovary using a digital camera as per the requirements of the experiment. Four different stages of ovarian development were observed, including the milky white transparent stage with underdeveloped ovaries, the yolk deposition stage with large slightly immature eggs, the ripening stage with bright yellow bead-shaped eggs and the end spawning stage with few or no egg grains.The mating sac of a wild type insect Helicoverpa armigera had a columnar right helix with an inner lumen. Mythimna separata had a G-shaped mating sac with dark brown bands. The mating sac of Agrotis ipsilon was linear with large coils outer back cysts.Spaelotis valida had a slightly brownish thin J-shaped mating sac, while Spodoptera exigua showed a white translucent dumbbell-shaped sac with a bubble cyst in the middle. The mating sac of Spodoptera litura was red with an upper milky white transparent mouth and a faintly visible internal cystic cavity. Pseudoptera lepigone mating sac was small and coiled with closed outer cysts.Mamestra brassicae had olive colored double coiled sacs with outer cysts. Old worm ovarian grading showed transparent and elastic ovarian ducts with grade one visible oocytes. At grade two, the ovarian duct became transparent with tender yellow eggs.At grade three, large fat bodies were absent with the duct being thickest at the ovipositor. Grades four and five showed clusters and fewer eggs in the ovaries with pale yellow and greenish color. All five ovarian grades were also observed in the armyworm, in the tarot caterpillar, and in the bollworm.