Stratégie alternative pour analyser l’invasion cellulaire in vitro de cultures 3D

Notre groupe de recherche se concentre principalement sur l’interaction entre le cancer et les cellules immunitaires. Notre objectif est d’étudier l’impact de divers mécanismes biologiques sur l’évolution du cancer de la tête et du cou par la modulation de l’immunité tumorale. Le but de ce protocole est d’évaluer l’invasion au sein de la matrice extracellulaire et une colocalisation spatiale de différents types de cellules dans un contexte multicouche.

L’avantage de ce protocole est l’utilisation d’hétérosphéroïdes incorporant deux types de cellules non néoplasiques pertinents aux côtés des cellules cancéreuses pour analyser l’invasion avec une matrice extracellulaire vers une membrane microporeuse et des stimuli de chimiotaxie. Pour commencer, ajoutez des nanoparticules magnétiques à la suspension cellulaire et mélangez 10 fois. Centrifugez les cellules à 400G pendant cinq minutes à température ambiante et mélangez 10 fois pour remettre les cellules en suspension.

Ensuite, transférez et mélangez toutes les cellules dans un nouveau tube pour la co-culture, et distribuez 100 microlitres de cellules co-cultivées dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-faible. Insérez le champ magnétique d’entraînement des sphéroïdes sous la plaque pour induire l’agrégation et la formation de sphéroïdes et placez-le dans l’incubateur pendant trois heures. À l’aide d’une pointe de 200 microlitres, ajoutez 50 microlitres d’ECM au centre d’une membrane microporeuse de 24 puits.

Éliminez les bulles à l’aide d’une aiguille stérile, en veillant à ce que la matrice recouvre uniformément la surface de la membrane. Incuber la membrane pendant une heure à 37 degrés Celsius pour la formation de gel. Pour commencer, préparez la culture cellulaire 3D et la membrane microporeuse recouverte d’une matrice extracellulaire.

Ajoutez 500 microlitres de milieu de culture, complété par 10% de sérum bovin fœtal dans la chambre inférieure de la membrane microporeuse comme attractif de chimiothérapie. Ensuite, retirez soigneusement le milieu des hétérosphéroïdes formés et ajoutez doucement 50 microlitres de milieu frais non supplémenté par puits sur le sphéroïde. À l’aide de ciseaux stériles, coupez le bord d’une pointe à faible rétention de 200 microlitres et récupérez le sphéroïde, ainsi que 50 microlitres de milieu.

Placez délicatement le sphéroïde sur la matrice extracellulaire. Ensuite, ajoutez soigneusement 150 microlitres de milieu non supplémenté goutte à goutte pour atteindre un volume total de 200 microlitres. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 48 heures.

Cliquez sur le fichier dans le logiciel d’analyse. Sélectionnez Ouvrir, puis choisissez l’image et cliquez sur OK. Cliquez ensuite sur analyser, puis sur définir les mesures pour sélectionner la surface, la densité intégrée et l’étiquette d’affichage.

Cliquez sur OK. Enfin, cliquez sur analyser, puis mesurer. Les images en champ clair représentent la localisation de sphéroïdes ou de cellules, identifiées par des conglomérats sombres ou noirs.

Les images des différentes cellules ont montré une variation de l’intensité et de la quantité de fluorescence sur différentes images le long de l’axe Z, indiquant différents modèles de prolifération et d’invasion entre les cellules. À l’aide de la microscopie confocale, différents canaux ont été superposés pour visualiser les modèles de colocalisation pendant l’invasion. L’analyse d’images des résultats représentatifs présentés a indiqué que les monocytes envahissent en premier, suivis des cellules néoplasiques, et que les fibroblastes sont les dernières cellules à envahir la matrice extracellulaire.