我们的研究小组主要关注癌症和免疫细胞之间的串扰。我们旨在通过调节肿瘤免疫来研究各种生物学机制对头颈癌进化的影响。该协议的目的是评估细胞外基质内的侵袭和多层环境中不同细胞类型的空间共定位。
该方案的优点是使用异球体，将两种相关的非肿瘤细胞类型与癌细胞一起结合，以分析细胞外基质对微孔膜和趋化性刺激的侵袭。首先，将磁性纳米颗粒添加到细胞悬液中并混合 10 次。在室温下以 400G 离心细胞 5 分钟，混合 10 次以重悬细胞。
然后将所有细胞转移到新管中并混合以进行共培养，并将 100 微升共培养的细胞分配到超低附着板的每个孔中。将球体驱动磁场插入板下方以诱导聚集和球体形成，并将其置于培养箱中 3 小时。使用 200 微升吸头，向 24 孔微孔膜的中心添加 50 微升 ECM。
用无菌针头去除气泡，确保基质均匀覆盖膜表面。将膜在 37 摄氏度下孵育 1 小时以形成凝胶。首先，准备 3D 细胞培养物和细胞外基质包被的微孔膜。
将 500 微升培养基，补充有 10% 胎牛血清添加到微孔膜的下腔中作为化疗引诱剂。然后小心地从形成的异质球体中取出培养基，并在球体上每孔轻轻加入 50 μL 新鲜的未补充培养基。使用无菌剪刀剪下 200 μL 低吸附尖端的边缘，并收集球体以及 50 μL 培养基。
轻轻地将球体放在细胞外基质的顶部。接下来，小心地逐滴加入 150 微升未添加的培养基，以达到 200 微升的总体积。将板放入培养箱中 48 小时。
单击分析软件中的文件。选择 可选，然后选择图像并单击 确定.然后单击 analyze（分析），然后单击 set measurements（设置测量值）以选择面积、积分密度和显示标签。
点击 Ok.最后单击 analyze（分析），然后单击 measure（测量）。明场图像表示球状体或细胞定位，由深色或黑色砾岩识别。
不同细胞的图像在沿 Z 轴的不同图像中表现出荧光强度和数量的差异，表明细胞之间的增殖和侵袭模式不同。使用共聚焦显微镜，叠加不同的通道以可视化侵袭过程中的共定位模式。对所呈现的代表性结果的图像分析表明，单核细胞首先侵入，其次是肿瘤细胞，成纤维细胞是最后侵入细胞外基质的细胞。
