Il nostro gruppo di ricerca si concentra principalmente sul crosstalk tra il cancro e le cellule immunitarie. Il nostro obiettivo è quello di studiare l'impatto di vari meccanismi biologici sull'evoluzione del cancro della testa e del collo attraverso la modulazione dell'immunità tumorale. Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare l'invasione all'interno della matrice extracellulare e una colocalizzazione spaziale di diversi tipi cellulari in un contesto multistrato.
Il vantaggio di questo protocollo è l'uso di eterosferoidi che incorporano due tipi di cellule non neoplastiche rilevanti accanto alle cellule tumorali per analizzare l'invasione con matrice extracellulare sia verso una membrana microporosa che verso stimoli chemiotassi. Per iniziare, aggiungere nanoparticelle magnetiche alla sospensione cellulare e mescolare 10 volte. Centrifugare le celle a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente e mescolare 10 volte per risospendere le cellule.
Quindi trasferire e mescolare tutte le cellule in una nuova provetta per la co-coltura e dosare 100 microlitri di cellule co-coltivate in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa. Inserire il campo magnetico dell'unità sferoidale sotto la piastra per indurre l'aggregazione e la formazione di sferoidi e posizionarlo nell'incubatrice per tre ore. Utilizzando un puntale da 200 microlitri, aggiungere 50 microlitri di ECM al centro di una membrana microporosa a 24 pozzetti.
Rimuovere le bolle con un ago sterile, assicurandosi che la matrice copra uniformemente la superficie della membrana. Incubare la membrana per un'ora a 37 gradi Celsius per la formazione del gel. Per iniziare, preparare la coltura cellulare 3D e la membrana microporosa rivestita di matrice extracellulare.
Aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura, integrato con il 10% di siero fetale bovino nella camera inferiore della membrana microporosa come chemioattrattivo. Quindi rimuovere con cura il terreno dagli eterosferoidi formati e aggiungere delicatamente 50 microlitri di terreno fresco non integrato per pozzetto sopra lo sferoide. Utilizzando delle forbici sterili, tagliare il bordo di una punta a bassa ritenzione da 200 microlitri e raccogliere lo sferoide, insieme a 50 microlitri di terreno.
Posizionare delicatamente lo sferoide sopra la matrice extracellulare. Successivamente, aggiungere con cura 150 microlitri di terreno non integrato, goccia a goccia, per raggiungere un volume totale di 200 microlitri. Mettere la piastra nell'incubatrice per 48 ore.
Fare clic su File nel software di analisi. Seleziona Apri, quindi scegli l'immagine e fai clic su OK. Quindi fare clic su Analizza, seguito da Imposta misurazioni per selezionare l'area, la densità integrata e l'etichetta di visualizzazione.
Clicca su ok. Infine fare clic su analizza e quindi su misura. Le immagini in campo chiaro rappresentano la localizzazione di sferoidi o cellule, identificate da conglomerati scuri o neri.
Le immagini delle diverse cellule hanno mostrato variazioni nell'intensità e nella quantità di fluorescenza tra le diverse immagini lungo l'asse Z, indicando diversi modelli di proliferazione e invasione tra le cellule. Utilizzando la microscopia confocale, sono stati sovrapposti diversi canali per visualizzare i modelli di colocalizzazione durante l'invasione. L'analisi delle immagini dei risultati rappresentativi presentati ha indicato che i monociti invadono per primi, seguiti dalle cellule neoplastiche, e i fibroblasti sono le ultime cellule a invadere la matrice extracellulare.
