אנו חוקרים כיצד כרוב מגיב לחמצן נמוך ברמה המולקולרית. מכיוון שקשה להשיג כרובים, אנו מפתחים מערכת המשתמשת בתאי כרוב מבודדים. על-ידי חשיפת התאים הרזרביים האלה, הידועים גם בשם פרוטופלסטים, לתנאים דלי חמצן, אנו יכולים לחקור את תגובת העקה שלהם בקלות.
עבודה עם פרוטופלסט שמושהה בתמיסה כדי לחקור תגובות דלות חמצן היא מסובכת. האתגר הגדול הוא לשמור מספיק חמצן לדגימות הבקרה שלנו. מצאנו דרך לשאוב את החמצן שבנוזל.
תיקפנו את השיטה באמצעות בדיקות כתב של סמני היפוקסיה. בדקנו שיטות שונות לטיפול בחמצן נמוך וגילינו שחבילת סופגי החמצן עובדת הכי טוב. הוא קל לשימוש ויעיל, מה שהופך אותו נהדר לחקר האופן שבו פרוטופלסטים מתנהגים בתנאים דלי חמצן.
חקר המנגנון המולקולרי בגידולי עלים בתנאי היפוקסיה היה מאתגר בשל מגבלת הכלים הזמינים, אך עם ההתקדמות האחרונה, התקדמנו מאוד על ידי שימוש במערכת פרוטופלסטים של כרוב עם טיפול בהיפוקסיה. שיטה חדשה זו מסייעת לנו להבין כיצד חמצן נמוך משפיע על צמחים אלה ברמה המולקולרית. בעתיד, אנו מתכננים לשלב את מערכת הפרוטופלסטים עם משקעים חיסוניים ומבחני כתבים כדי להמחיש את מסלול הבקרה המולקולרי המעורב בכרוב במהלך עקת הצפה.
מטרתנו היא לזהות רגולטורים מרכזיים של עמידות להצפות, ואנו מקווים שנסייע בגידול זן כרוב חדש עם עמידות משופרת להצפות. כדי להתחיל, ממלאים את החורים העגולים בצורת ריבוע של מגש תקע 48 בארות במצע צמחי מסחרי וזורעים פויודורי ו-228 זרעי כרוב בעומק של כסנטימטר לתוך מצע הגידול. להכנת 12.5 מיליליטר של תמיסת אנזים, חממו מראש תמיסה המכילה MES של 10 מילימולר ומניטול מולרי 0.6 בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן להוסיף 1.5% צלולאז R-10 ו 0.75% macerozyme R-10. מערבבים את התמיסה וממשיכים לחמם בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הניחו לתמיסת האנזים להתקרר לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן להוסיף 10 מילימולר סידן כלורי ו 0.1% אלבומין בסרום בקר. באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, מעקרים את תמיסת האנזים לתוך צלחת פטרי של תשעה סנטימטרים. לאחר שבועיים-שלושה של צמיחה, אספו שתילי כרוב בשלב העלה השני לבידוד מזופיל פרוטופלסט.
אספו את העלים האמיתיים המורחבים השניים מחמישה עד שמונה שתילי כרוב. בעזרת סכין גילוח חד, פורסים את העלים לרצועות של 0.5 עד 1.0 מילימטר. העבירו מיד את רצועות העלים לתמיסת אנזים טרייה.
יש להעביר את רצועות עלי הכרוב לחדירת ואקום בחושך למשך 30 דקות. לאחר חדירת ואקום, יש לשמור את רצועות העלים שקועות בתמיסת האנזים בחושך למשך ארבע עד 16 שעות. למחרת, לדלל את התמיסה המכילה פרוטופלסטים עם נפח שווה של תמיסת W5 כדי לעצור את העיכול האנזימטי.
כדי לשחרר את ההשעיה של הפרוטופלסטים, מערבלים בעדינות את התערובת על שייקר מסלולי. לאחר מכן סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הפתרון protoplast ב 150 G במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הוסף 10 מיליליטר של תמיסת W5 לאורך דופן הצינור בקצב זרימה של כמיליליטר אחד לשנייה כדי לשטוף את הפרוטופלסטים הכדוריים. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת W5 והנח את הצינור על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן הסירו מיליליטר אחד של סופרנאטנט בכל פעם עד שכל הסופרנאטנט מוסר.
השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת MMG מקוררת מראש בקרח. למדוד את ריכוז protoplast באמצעות hemocytometer. כוונן את הריכוז הסופי ל 4 פעמים 10 לעוצמה של 5 פרוטופלסטים למיליליטר באמצעות תמיסת MMG.
לאחר הבידוד והעיכול בלילה, יבול הפרוטופלסטים היה פי 1.04 פי 10 בחזקת 7 עבור פויודורי ופי 4.00 פי 10 בחזקת 6 פרוטופלסטים לגרם משקל טרי עבור 228. יעילות הטרנספקציה של פרוטופלסט הייתה מעל 40% הן בפויודורי והן ב-228 זנים, כפי שהודגם על ידי הגן GFP reporter. לאחר בידוד פרוטופלסט כרוב, מערבבים 100 מיקרוליטר של 4 פעמים 10 בחזקת 4 פרוטופלסטים עם 10 מיקרוליטר פלסמיד ומניחים את התערובת על קרח למשך 10 דקות.
הוסיפו נפח שווה של תמיסת PEG טרייה לתמיסת הפרוטופלסט וערבבו בעדינות. דוגרים על תערובת הפרוטופלסט בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסף 440 מיקרוליטר של תמיסת W5 כדי לסיים את התגובה.
צנטריפוגה את הפרוטופלסטים הנגועים ב 150 G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את הגלולה ב-750 מיקרוליטר של תמיסת W5 מועשרת בחמצן. מעבירים את הפרוטופלסטים המרחפים מחדש לצלחת תרבית רקמה בת שש בארות המקודדת מראש עם אלבומין בסרום בקר 1%.
להיפוקסיה הנגרמת על ידי שקית המכילה חמצן, הניחו צלחת המכילה תמיסת פרוטופלסט W5 בצנצנת אנאירובית בנפח 3.5 ליטר. לאחר מכן הוסיפו לצנצנת שתי חבילות בולמי חמצן ליצירת סביבה היפוקסית. לאחר הטיפול, צנטריפוגות את הפרוטופלסטים ב 150 G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופרנאטנט והקפיאו את הפרוטופלסטים שנאספו בחנקן נוזלי לפני שתמשיכו לבדיקת לוציפראז כפולה. חבילת בולמי החמצן גרמה לעלייה של פי 7.0 בפעילות מקדם BoADH1 בהשוואה לקבוצת הביקורת, והדגימה את התגובה ההיפוקסית הגבוהה ביותר. פעילות מקדם BoSUS1L גדלה ביותר מפי 5.6, כאשר הטיפול בחבילת סופגי החמצן הראה את האינדוקציה הגדולה ביותר מבין הטיפולים.
