우리는 양배추가 분자 수준에서 낮은 산소에 어떻게 반응하는지 연구하고 있습니다. 양배추는 구하기 어렵기 때문에 분리된 양배추 세포를 사용하는 시스템을 개발하고 있습니다. 원형질체(protoplast)라고도 하는 이러한 예비 세포를 저산소 조건에 노출시킴으로써, 우리는 그들의 스트레스 반응을 쉽게 조사할 수 있습니다.
저산소 반응을 연구하기 위해 용액에 현탁된 프로토플라스트를 사용하는 것은 까다롭습니다. 가장 큰 과제는 대조군 샘플에 충분한 산소를 유지하는 것입니다. 우리는 액체의 산소를 펌핑하는 방법을 알아냈습니다.
저산소증 마커에 대한 Reporter 분석을 통해 그 방법을 검증하였습니다. 저산소를 처리하는 다양한 방법을 확인한 결과 탈산소제 팩이 가장 잘 작동한다는 것을 알았습니다. 사용하기 쉽고 효과적이어서 산소가 적은 조건에서 원형질체가 어떻게 행동하는지 연구하는 데 적합합니다.
저산소증 상태에서 잎이 많은 작물의 분자 메커니즘을 연구하는 것은 사용 가능한 도구의 제한으로 인해 어려웠지만, 최근의 발전으로 저산소증 치료와 함께 양배추 원형질체 시스템을 사용함으로써 큰 진전을 이루었습니다. 이 새로운 방법은 낮은 산소가 분자 수준에서 이러한 식물에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 도움이 됩니다. 앞으로 우리는 프로토플라스트 시스템을 면역침전 및 리포터 분석과 결합하여 홍수 스트레스 동안 양배추와 관련된 분자 조절 경로를 설명할 계획입니다.
우리의 목표는 홍수 내성의 주요 조절 인자를 식별하는 것이며, 이를 통해 홍수 내성이 향상된 새로운 양배추 품종을 육종하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 시작하려면 48웰 플러그 트레이의 둥근 사각형 모양의 구멍을 상업용 식물 기질로 채우고 후유도도리와 228개의 양배추 씨앗을 재배 배지에 약 1cm 깊이로 파종합니다. 12.5ml의 효소 용액을 준비하려면 10밀리몰의 MES와 0.6몰의 만니톨이 포함된 용액을 섭씨 55도에서 예열합니다.
그런 다음 1.5%셀룰라아제 R-10 및 0.75%마케로자임 R-10을 추가합니다. 용액을 저어주고 섭씨 55도에서 10분 동안 계속 예열합니다. 효소 용액을 실온으로 식히십시오.
그런 다음 10 밀리몰 염화칼슘과 0.1% 소 혈청 알부민을 추가합니다. 0.22마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 효소 용액을 9cm 페트리 접시에 살균합니다. 2-3주간의 성장 후, 중엽 원형질체 분리를 위해 두 번째 잎 단계에서 양배추 묘목을 수집합니다.
5개에서 8개의 양배추 묘목에서 새로 확장된 두 번째 진잎을 수집합니다. 날카로운 면도날을 사용하여 잎을 0.5-1.0mm 스트립으로 자릅니다. 잎 조각을 즉시 갓 준비한 효소 용액에 옮깁니다.
양배추 잎 스트립을 30분 동안 어둠 속에서 진공 침투시킵니다. 진공 침투 후에는 잎 조각을 4-16시간 동안 어두운 곳에서 효소 용액에 담그십시오. 다음날, protoplasts' 함유 용액을 동일한 부피의 W5 용액으로 희석하여 효소 분해를 중단합니다.
프로토플라스트의 현탁액을 방출하려면 안와 셰이커에서 혼합물을 부드럽게 휘젓습니다. 그런 다음 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 여과합니다. 프로토플라스트 용액을 150G에서 섭씨 4도에서 2분간 원심분리합니다.
초당 약 1ml의 유속으로 튜브 벽을 따라 10ml의 W5 용액을 추가하여 펠릿화된 원형체를 세척합니다. 마지막 원심분리 후, 프로톱플라스트를 W5 용액에 다시 현탁시키고 튜브를 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 그런 다음 모든 상등액이 제거될 때까지 한 번에 1ml의 상층액을 제거합니다.
원형질체를 얼음 미리 냉각된 MMG 용액에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 원형질체 농도를 측정합니다. MMG 용액을 사용하여 최종 농도를 4 곱하기 10으로 10 밀리리터당 5 프로톱플라스트의 거듭제곱으로 조정합니다.
분리 및 하룻밤 동안의 소화 후, 원형질체의 수율은 후유도리의 경우 1.04 곱하기 10의 7승, 4.00 곱하기 10의 6의 곱하기 228의 신선한 무게였습니다. 프로토플라스트 transfection 효율은 GFP 리포터 유전자에 의해 입증된 바와 같이 Fuyudori와 228개 품종 모두에서 40% 이상이었습니다. 양배추 프로토플라스트를 분리한 후, 100마이크로리터의 4 곱하기 10 프로토플라스트의 거듭제곱을 10마이크로리터의 플라스미드와 섞어 얼음 위에 10분 동안 올려 놓습니다.
갓 준비한 PEG 용액을 동일한 부피의 원형아체 용액에 넣고 부드럽게 섞습니다. 프로토플라스트 혼합물을 실온에서 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 440 마이크로 리터의 W5 용액을 추가하여 반응을 종결합니다.
형질주입된 프로톱피스를 원심분리기로 150G에서 섭씨 4도에서 2분간 사용합니다. 펠릿을 750마이크로리터의 산소가 풍부한 W5 용액에 재현탁합니다. 재현탁된 프로토플라스트를 1% 소 혈청 알부민이 사전 코딩된 6웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.
산소 소모 백으로 인한 저산소증의 경우, W5 원형질체 용액이 들어있는 플레이트를 3.5리터 혐기성 병에 넣습니다. 그런 다음 용기에 두 개의 산소 흡수 팩을 추가하여 저산소 환경을 만듭니다. 처리 후 프로토플라스트를 섭씨 4도에서 2분 동안 150G으로 원심분리합니다.
이중 루시페라제 분석을 진행하기 전에 상등액을 버리고 수집된 프로토플라스를 액체 질소에 동결합니다. 산소흡수팩은 대조군에 비해 BoADH1 프로모터 활성을 7.0배 증가시켜 가장 높은 저산소 반응을 보였다. BoSUS1L 프로모터 활성은 5.6배 이상 증가했으며, 산소흡수팩 처리는 처리제 중 가장 큰 유도를 보였다.
