Wir untersuchen, wie Kohlköpfe auf molekularer Ebene auf Sauerstoffmangel reagieren. Da Kohl schwer zu bekommen ist, entwickeln wir ein System mit isolierten Kohlzellen. Indem wir diese überschüssigen Zellen, die auch als Protoplasten bezeichnet werden, sauerstoffarmen Bedingungen aussetzen, können wir ihre Stressreaktion leicht untersuchen.
Die Arbeit mit Protoplasten, die in Lösung suspendiert sind, um sauerstoffarme Reaktionen zu untersuchen, ist schwierig. Die große Herausforderung besteht darin, genügend Sauerstoff für unsere Kontrollproben zu halten. Wir haben einen Weg gefunden, den Sauerstoff in der Flüssigkeit abzupumpen.
Wir haben die Methode durch Reporter-Assays von Hypoxie-Markern validiert. Wir haben uns verschiedene Methoden für den Umgang mit niedrigem Sauerstoffgehalt angesehen und festgestellt, dass das Sauerstoffabsorberpaket am besten funktioniert. Es ist einfach zu bedienen und effektiv, was es ideal macht, um zu untersuchen, wie sich Protoplasten unter sauerstoffarmen Bedingungen verhalten.
Die Untersuchung des molekularen Mechanismus in Blattkulturen unter Hypoxie-Bedingungen war aufgrund der begrenzten verfügbaren Werkzeuge eine Herausforderung, aber mit den jüngsten Fortschritten haben wir große Fortschritte gemacht, indem wir ein Kohl-Protoplasten-System mit Hypoxie-Behandlung verwendet haben. Diese neue Methode hilft uns zu verstehen, wie sich ein niedriger Sauerstoffgehalt auf molekularer Ebene auf diese Pflanzen auswirkt. In Zukunft planen wir, das Protoplasten-System mit Immunpräzipitation und Reporter-Assays zu kombinieren, um den molekularen Regulationsweg im Kohl bei Überschwemmungsstress abzubilden.
Unser Ziel ist es, die wichtigsten Regulatoren der Überschwemmungstoleranz zu identifizieren, von denen wir hoffen, dass wir sie bei der Züchtung einer neuen Kohlsorte mit verbesserter Überschwemmungstoleranz unterstützen können. Füllen Sie zunächst die runden, quadratischen Löcher einer 48-Well-Steckschale mit handelsüblichem Pflanzensubstrat und säen Sie Fuyudori und 228 Kohlsamen etwa einen Zentimeter tief in das Kultursubstrat. Um 12,5 Milliliter Enzymlösung herzustellen, erhitzen Sie eine Lösung, die 10 Millimolar MES und 0,6 Molar Mannitol enthält, auf 55 Grad Celsius.
Fügen Sie dann 1,5 % Cellulase R-10 und 0,75 % Macerozym R-10 hinzu. Rühren Sie die Lösung um und erwärmen Sie sie 10 Minuten lang bei 55 Grad Celsius. Lassen Sie die Enzymlösung auf Raumtemperatur abkühlen.
Fügen Sie dann 10 millimolares Calciumchlorid und 0,1 % Rinderserumalbumin hinzu. Sterilisieren Sie die Enzymlösung mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter in eine neun Zentimeter große Petrischale. Nach zwei bis drei Wochen Wachstum sammeln Sie Kohlsämlinge im zweiten Blattstadium für die Isolierung der Mesophyll-Protoplasten.
Sammeln Sie die zweiten, neu expandierten echten Blätter von fünf bis acht Kohlsämlingen. Schneide die Blätter mit einer scharfen Rasierklinge in 0,5 bis 1,0 Millimeter große Streifen. Sofort die Blattstreifen in die frisch zubereitete Enzymlösung überführen.
Die Kohlblattstreifen im Dunkeln 30 Minuten lang einer Vakuuminfiltration aussetzen. Lassen Sie die Blattstreifen nach der Vakuuminfiltration vier bis 16 Stunden im Dunkeln in die Enzymlösung eintauchen. Am nächsten Tag verdünnen Sie die die Protoplasten enthaltende Lösung mit einem gleichen Volumen W5-Lösung, um den enzymatischen Verdau zu stoppen.
Um die Suspension der Protoplasten freizusetzen, schwenken Sie die Mischung vorsichtig auf einem Orbitalschüttler. Filtrieren Sie dann die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Protoplastenlösung bei 150 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius.
Geben Sie 10 Milliliter W5-Lösung mit einer Durchflussrate von etwa einem Milliliter pro Sekunde entlang der Rohrwand, um die pelletierten Protoplasten zu waschen. Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren Sie die Protoplasten in der W5-Lösung und stellen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis. Entfernen Sie dann jeweils einen Milliliter Überstand, bis der gesamte Überstand entfernt ist.
Resuspendieren Sie die Protoplasten in einer eisgekühlten MMG-Lösung. Messen Sie die Protoplastenkonzentration mit einem Hämozytometer. Die Endkonzentration wird mit der MMG-Lösung auf 4 mal 10 hoch 5 Protoplasten pro Milliliter eingestellt.
Nach der Isolierung und der Verdauung über Nacht betrug die Ausbeute an Protoplasten 1,04 mal 10 hoch 7 für Fuyudori und 4,00 mal 10 hoch 6 Protoplasten pro Gramm Frischgewicht für 228. Die Transfektionseffizienz von Protoplast lag sowohl bei Fuyudori als auch bei 228 Sorten bei über 40 %, wie das GFP-Reportergen zeigte. Nach der Isolierung des Kohlprotoplasten 100 Mikroliter 4 mal 10 hoch 4 Protoplasten mit 10 Mikrolitern Plasmid mischen und die Mischung 10 Minuten lang auf Eis legen.
Geben Sie die gleiche Menge frisch zubereiteter PEG-Lösung in die Protoplastenlösung und mischen Sie sie vorsichtig. Inkubieren Sie die Protoplastenmischung bei Raumtemperatur im Dunkeln 10 Minuten lang. Fügen Sie dann 440 Mikroliter W5-Lösung hinzu, um die Reaktion zu beenden.
Zentrifugieren Sie die transfizierten Protoplasten bei 150 G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Das Pellet wird in 750 Mikrolitern sauerstoffangereicherter W5-Lösung resuspendiert. Übertragen Sie die resuspendierten Protoplasten auf eine Sechs-Well-Gewebekulturplatte, die mit 1 % Rinderserumalbumin vorkodiert ist.
Bei sauerstoffverbrauchender beutelinduzierter Hypoxie legen Sie eine Platte mit W5-Protoplastenlösung in ein anaerobes 3,5-Liter-Glas. Geben Sie dann zwei Sauerstoffabsorberpakete in das Glas, um eine hypoxische Umgebung zu schaffen. Nach der Behandlung zentrifugieren Sie die Protoplasten bei 150 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie die gesammelten Protoplasten in flüssigem Stickstoff ein, bevor Sie mit dem dualen Luciferase-Assay fortfahren. Das Sauerstoffabsorberpaket induzierte eine 7,0-fache Erhöhung der BoADH1-Promotoraktivität im Vergleich zur Kontrolle, was die höchste hypoxische Reaktion zeigte. Die Promotoraktivität von BoSUS1L stieg um mehr als das 5,6-fache, wobei die Behandlung mit dem Sauerstoffabsorberpack die größte Induktion unter den Behandlungen zeigte.
