Estamos estudando como os repolhos reagem ao baixo oxigênio em nível molecular. Como os repolhos são difíceis de obter, estamos desenvolvendo um sistema usando células isoladas de repolho. Ao expor essas células sobressalentes, também conhecidas como protoplastos, a condições de baixo oxigênio, podemos investigar facilmente sua resposta ao estresse.
Trabalhar com protoplastos suspensos em solução para estudar respostas de baixo oxigênio é complicado. O grande desafio é manter oxigênio suficiente para nossas amostras de controle. Descobrimos uma maneira de bombear o oxigênio do líquido.
Validamos o método por meio de ensaios repórter de marcadores de hipóxia. Verificamos diferentes métodos para lidar com baixo oxigênio e descobrimos que o pacote absorvedor de oxigênio funciona melhor. É fácil de usar e eficaz, tornando-o ótimo para estudar como os protoplastos se comportam em condições de baixo oxigênio.
Estudar o mecanismo molecular em culturas folhosas sob condições de hipóxia tem sido um desafio devido à limitação das ferramentas disponíveis, mas com os avanços recentes, fizemos um grande progresso usando um sistema de protoplastos de repolho com tratamento de hipóxia. Este novo método está nos ajudando a entender como o baixo oxigênio afeta essas plantas em nível molecular. No futuro, planejamos combinar o sistema de protoplastos com ensaios de imunoprecipitação e repórter para ilustrar a via regulatória molecular envolvida no repolho durante o estresse por inundação.
Nosso objetivo é identificar os principais reguladores da tolerância a inundações, que esperamos ajudar na criação de uma nova cultivar de repolho com melhor tolerância a inundações. Para começar, preencha os orifícios redondos em forma de quadrado de uma bandeja de 48 poços com substrato de planta comercial e semeie Fuyudori e 228 sementes de repolho com aproximadamente um centímetro de profundidade no meio de cultivo. Para preparar 12,5 mililitros de solução enzimática, pré-aqueça uma solução contendo 10 milimolares MES e 0,6 molar manitol a 55 graus Celsius.
Em seguida, adicione 1,5% de celulase R-10 e 0,75% de macerozima R-10. Mexa a solução e continue aquecendo a 55 graus Celsius por 10 minutos. Deixe a solução enzimática esfriar até a temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 10 milimolares de cloreto de cálcio e 0,1% de albumina de soro bovino. Usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetro, esterilize a solução enzimática em uma placa de Petri de nove centímetros. Após duas a três semanas de crescimento, colete mudas de repolho no estágio da segunda folha para isolamento do protoplasto do mesofilo.
Colete as segundas folhas verdadeiras recém-expandidas de cinco a oito mudas de repolho. Usando uma lâmina de barbear afiada, corte as folhas em tiras de 0,5 a 1,0 milímetro. Transfira imediatamente as tiras de folhas para a solução enzimática recém-preparada.
Sujeite as tiras de folhas de repolho à infiltração de vácuo no escuro por 30 minutos. Após a infiltração a vácuo, mantenha as tiras de folhas imersas na solução enzimática no escuro por quatro a 16 horas. No dia seguinte, diluir a solução contendo protoplastos com um volume igual de solução W5 para interromper a digestão enzimática.
Para liberar a suspensão dos protoplastos, gire suavemente a mistura em um agitador orbital. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a solução de protoplastos a 150 g durante dois minutos a quatro graus Celsius.
Adicione 10 mililitros de solução W5 ao longo da parede do tubo a uma taxa de fluxo de aproximadamente um mililitro por segundo para lavar os protoplastos peletizados. Após a última centrifugação, ressuspender os protoplastos na solução W5 e colocar o tubo no gelo durante 30 minutos. Em seguida, remova um mililitro de sobrenadante de cada vez até que todo o sobrenadante seja removido.
Ressuspenda os protoplastos em uma solução MMG pré-resfriada com gelo. Meça a concentração de protoplastos usando um hemocitômetro. Ajuste a concentração final para 4 vezes 10 elevado à potência de 5 protoplastos por mililitro usando a solução MMG.
Após o isolamento e digestão durante a noite, o rendimento dos protoplastos foi de 1,04 vezes 10 elevado a 7 para Fuyudori e 4,00 vezes 10 elevado a 6 protoplastos por grama de peso fresco para 228. A eficiência de transfecção de protoplastos foi superior a 40% nas cultivares Fuyudori e 228, conforme demonstrado pelo gene repórter GFP. Depois de isolar o protoplasto de repolho, misture 100 microlitros de 4 vezes 10 à potência de 4 protoplastos com 10 microlitros de plasmídeo e coloque a mistura no gelo por 10 minutos.
Adicione um volume igual de solução de PEG recém-preparada à solução de protoplasto e misture delicadamente. Incube a mistura de protoplastos em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos. Em seguida, adicione 440 microlitros de solução W5 para encerrar a reação.
Centrifugue os protoplastos transfectados a 150 G por dois minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em 750 microlitros de solução W5 enriquecida com oxigênio. Transfira os protoplastos ressuspensos para uma placa de cultura de tecidos de seis poços pré-codificada com albumina de soro bovino a 1%.
Para hipóxia induzida por bolsa que consome oxigênio, coloque uma placa contendo solução de protoplasto W5 em um frasco anaeróbico de 3,5 litros. Em seguida, adicione dois pacotes de absorvedores de oxigênio no frasco para criar um ambiente hipóxico. Após o tratamento, centrifugar os protoplastos a 150 G durante dois minutos a quatro graus Celsius.
Rejeitar o sobrenadante e congelar os protoplastos recolhidos em azoto líquido antes de proceder ao ensaio de luciferase dupla. O pacote absorvedor de oxigênio induziu um aumento de 7,0 vezes na atividade do promotor BoADH1 em comparação com o controle, demonstrando a maior resposta hipóxica. A atividade do promotor BoSUS1L aumentou mais de 5,6 vezes, com o tratamento com pacote absorvedor de oxigênio apresentando a maior indução entre os tratamentos.
