Lahanaların moleküler düzeyde düşük oksijene nasıl tepki verdiğini inceliyoruz. Lahana elde etmek zor olduğu için, izole edilmiş lahana hücrelerini kullanan bir sistem geliştiriyoruz. Protoplastlar olarak da bilinen bu yedek hücreleri düşük oksijenli koşullara maruz bırakarak, stres tepkilerini kolayca araştırabiliriz.
Düşük oksijen tepkilerini incelemek için çözelti içinde süspanse edilen protoplast ile çalışmak zordur. En büyük zorluk, kontrol numunelerimiz için yeterli oksijeni korumaktır. Sıvıdaki oksijeni dışarı pompalamanın bir yolunu bulduk.
Yöntemi, hipoksi belirteçlerinin raportör tahlilleri yoluyla doğruladık. Düşük oksijenle başa çıkmak için farklı yöntemleri inceledik ve oksijen emici paketin en iyi şekilde çalıştığını gördük. Kullanımı kolay ve etkilidir, bu da onu protoplastların düşük oksijen koşullarında nasıl davrandığını incelemek için harika kılar.
Hipoksi koşulları altında yapraklı bitkilerde moleküler mekanizmayı incelemek, mevcut araçların sınırlı olması nedeniyle zor olmuştur, ancak son gelişmelerle birlikte, hipoksi tedavisi ile bir lahana protoplast sistemi kullanarak büyük ilerleme kaydettik. Bu yeni yöntem, düşük oksijenin bu bitkileri moleküler düzeyde nasıl etkilediğini anlamamıza yardımcı oluyor. Gelecekte, taşkın stresi sırasında lahanada yer alan moleküler düzenleyici yolu göstermek için protoplast sistemini immünopresipitasyon ve raportör tahlilleri ile birleştirmeyi planlıyoruz.
Amacımız, taşkın toleransının temel düzenleyicilerini belirlemektir ve bu, gelişmiş taşkın toleransına sahip yeni bir lahana çeşidinin yetiştirilmesine yardımcı olacağımızı ummaktadır. Başlamak için, 48 oyuklu bir tapa tepsisinin yuvarlak kare şeklindeki deliklerini ticari bitki substratı ile doldurun ve Fuyudori ve 228 lahana tohumunu yetiştirme ortamının yaklaşık bir santimetre derinliğine ekin. 12.5 mililitre enzim çözeltisi hazırlamak için, 10 milimolar MES ve 0.6 molar mannitol içeren bir çözeltiyi 55 santigrat derecede önceden ısıtın.
Daha sonra% 1.5 selülaz R-10 ve% 0.75 macerozim R-10 ekleyin. Çözeltiyi karıştırın ve 10 dakika boyunca 55 santigrat derecede ısıtmaya devam edin. Enzim çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Daha sonra 10 milimolar kalsiyum klorür ve% 0.1 sığır serum albümini ekleyin. 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak, enzim çözeltisini dokuz santimetrelik bir Petri kabına sterilize edin. İki ila üç haftalık büyümeden sonra, mezofil protoplast izolasyonu için ikinci yaprak aşamasında lahana fidelerini toplayın.
İkinci yeni genişletilmiş gerçek yaprakları beş ila sekiz lahana fidesinden toplayın. Keskin bir tıraş bıçağı kullanarak yaprakları 0,5 ila 1,0 milimetrelik şeritler halinde dilimleyin. Yaprak şeritlerini hemen taze hazırlanmış enzim çözeltisine aktarın.
Lahana yaprağı şeritlerini karanlıkta 30 dakika boyunca vakum sızmasına tabi tutun. Vakum sızmasından sonra, yaprak şeritlerini karanlıkta dört ila 16 saat boyunca enzim çözeltisine batırılmış halde tutun. Ertesi gün, enzimatik sindirimi durdurmak için protoplast içeren çözeltiyi eşit hacimde W5 çözeltisi ile seyreltin.
Protoplastların süspansiyonunu serbest bırakmak için, karışımı bir orbital çalkalayıcı üzerinde hafifçe döndürün. Daha sonra hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Protoplast çözeltisini 150 G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin.
Peletlenmiş protoplastları yıkamak için tüpün duvarı boyunca saniyede yaklaşık bir mililitrelik bir akış hızında 10 mililitre W5 çözeltisi ekleyin. Son santrifüjlemeden sonra, W5 çözeltisindeki protoplastları yeniden süspanse edin ve tüpü 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, tüm süpernatan çıkarılana kadar bir seferde bir mililitre süpernatanı çıkarın.
Protoplastları buzla önceden soğutulmuş bir MMG çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak protoplast konsantrasyonunu ölçün. MMG çözeltisi kullanarak nihai konsantrasyonu mililitre başına 4 kez 10 üzeri 5 protoplastın gücüne ayarlayın.
İzolasyon ve gece boyunca sindirimi takiben, protoplastların verimi, Fuyudori için 1.04 kez 10 üzeri 7 ve 228 için gram taze ağırlık başına 4.00 çarpı 10 üzeri 6 protolast kuvveti idi. Protoplast transfeksiyon verimliliği, GFP raportör geni tarafından gösterildiği gibi, hem Fuyudori hem de 228 çeşitte% 40'ın üzerindeydi. Lahana protoplastını izole ettikten sonra, 10 mikrolitre 10 mikrolitre 4 protolastın gücüne 10 mikrolitre plazmid ile karıştırın ve karışımı 10 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
Protoplast çözeltisine eşit hacimde taze hazırlanmış PEG çözeltisi ekleyin ve hafifçe karıştırın. Protoplast karışımını oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Daha sonra reaksiyonu sonlandırmak için 440 mikrolitre W5 çözeltisi ekleyin.
Kesilen protoplastları 150 G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Peletleri 750 mikrolitre oksijenle zenginleştirilmiş W5 solüsyonunda yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş protoplastları% 1 sığır serum albümini ile önceden kodlanmış altı oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın.
Oksijen tüketen torba kaynaklı hipoksi için, 3,5 litrelik anaerobik bir kavanoza W5 protoplast çözeltisi içeren bir plaka yerleştirin. Ardından, hipoksik bir ortam oluşturmak için kavanoza iki oksijen emici paket ekleyin. Tedaviden sonra, protoplastları dört santigrat derecede iki dakika boyunca 150 G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve ikili lusiferaz testine geçmeden önce toplanan protoplastları sıvı nitrojen içinde dondurun. Oksijen emici paketi, kontrole kıyasla BoADH1 promotör aktivitesinde 7.0 kat artışa neden oldu ve en yüksek hipoksik yanıtı gösterdi. BoSUS1L promotör aktivitesi 5.6 kattan fazla arttı ve oksijen emici paket tedavisi tedaviler arasında en büyük indüksiyonu gösterdi.
