Мы изучаем, как капуста реагирует на низкий уровень кислорода на молекулярном уровне. Поскольку капусту трудно достать, мы разрабатываем систему с использованием изолированных капустных клеток. Подвергая эти резервные клетки, также известные как протопласты, воздействию кислорода в условиях, связанных с низким содержанием кислорода, мы можем легко исследовать их реакцию на стресс.
Работа с протопластами, взвешенными в растворе, для изучения реакций с низким содержанием кислорода сложна. Большая проблема заключается в том, чтобы сохранить достаточное количество кислорода для наших контрольных образцов. Мы придумали способ откачки кислорода из жидкости.
Мы валидировали метод с помощью репортерных анализов маркеров гипоксии. Мы изучили различные методы работы с низким содержанием кислорода и обнаружили, что лучше всего работает пакет с поглотителем кислорода. Он прост в использовании и эффективен, что делает его отличным для изучения того, как протопласты ведут себя в условиях низкого содержания кислорода.
Изучение молекулярного механизма в листовых культурах в условиях гипоксии было сложной задачей из-за ограниченности доступных инструментов, но с недавним прогрессом мы добились большого прогресса, используя систему протопластов капусты с лечением гипоксии. Этот новый метод помогает нам понять, как низкий уровень кислорода влияет на эти растения на молекулярном уровне. В будущем мы планируем объединить систему протопластов с иммунопреципитацией и репортерными анализами, чтобы проиллюстрировать молекулярный регуляторный путь, участвующий в капусте во время стресса от наводнения.
Наша цель состоит в том, чтобы определить ключевые регуляторы устойчивости к затоплению, которые, как мы надеемся, помогут в выведении нового сорта капусты с улучшенной устойчивостью к затоплению. Для начала заполните круглые квадратные отверстия 48-луночного противня коммерческим растительным субстратом и посейте семена Fuyudori и 228 семян капусты примерно на один сантиметр вглубь питательной среды. Для приготовления 12,5 миллилитров раствора фермента разогрейте раствор, содержащий 10 миллимолярных MES и 0,6 молярного маннитола, до 55 градусов Цельсия.
Затем добавьте 1,5% целлюлазы R-10 и 0,75% мацероцима R-10. Перемешайте раствор и продолжайте нагревать при температуре 55 градусов Цельсия в течение 10 минут. Дайте ферментному раствору остыть до комнатной температуры.
Затем добавьте 10 миллимоляров хлорида кальция и 0,1% бычьего сывороточного альбумина. С помощью шприцевого фильтра толщиной 0,22 микрометра стерилизуйте раствор фермента в девятисантиметровую чашку Петри. Через две-три недели роста соберите рассаду капусты на второй стадии листьев для выделения мезофилла протопластов.
Соберите вторые только что раскрывшиеся истинные листья от пяти до восьми рассадных капуст. С помощью острого лезвия бритвы нарежьте листья полосками от 0,5 до 1,0 миллиметров. Сразу же переложите полоски листьев в свежеприготовленный ферментный раствор.
Подвергните полоски капустных листьев вакуумной инфильтрации в темноте в течение 30 минут. После вакуумной инфильтрации подержите полоски листьев погруженными в раствор фермента в темноте от четырех до 16 часов. На следующий день разбавьте раствор, содержащий протопласты, равным объемом раствора W5, чтобы остановить ферментативное расщепление.
Чтобы высвободить суспензию протопластов, аккуратно взбейте смесь на орбитальном шейкере. Затем отфильтруйте клеточную суспензию через 70-микрометровый клеточный фильтр в 50-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте раствор протопластов при 150 G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.
Добавьте 10 миллилитров раствора W5 вдоль стенки трубки со скоростью потока примерно один миллилитр в секунду, чтобы промыть гранулированные протопласты. После последнего центрифугирования повторно суспендируйте протопласты в растворе W5 и поместите пробирку на лед на 30 минут. Затем удаляйте по одному миллилитру надосадочной жидкости за раз, пока не будет удалена вся надосадочная жидкость.
Ресуспендируйте протопласты в замороженном растворе MMG. Измерьте концентрацию протопластов с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте конечную концентрацию до 4 умножить на 10 в степени 5 протопластов на миллилитр, используя раствор ММГ.
После выделения и ночного разложения выход протопластов составил 1,04 умножить на 10 в степени 7 для Фуюдори и в 4,00 умножить на 10 в степени 6 протопластов на грамм свежего веса для 228. Эффективность трансфекции протопластов была выше 40% как у Fuyudori, так и у 228 сортов, что продемонстрировал репортерный ген GFP. После выделения капустного протопласта смешайте 100 микролитров 4 раза по 10 в силе 4 протопласта с 10 микролитрами плазмиды и поместите смесь на лед на 10 минут.
Добавьте равный объем свежеприготовленного раствора ПЭГ в раствор протопласта и аккуратно перемешайте. Инкубируйте смесь протопластов при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут. Затем добавьте 440 микролитров раствора W5, чтобы завершить реакцию.
Центрифугируйте трансфицированные протопласты при 150 G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Суспендируйте гранулу в 750 микролитрах обогащенного кислородом раствора W5. Перенесите ресуспендированные протопласты в шестилуночный планшет для культуры тканей, предварительно закодированный 1%-ным бычьим сывороточным альбумином.
При гипоксии, вызванной потреблением кислорода, поместите пластину, содержащую раствор протопласта W5, в 3,5-литровую анаэробную банку. Затем добавьте в банку два пакета поглотителей кислорода, чтобы создать гипоксическую среду. После обработки центрифугируйте протопласты при 150 G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.
Выбросьте надосадочную жидкость и заморозьте собранные протопласты в жидком азоте, прежде чем приступить к двойному анализу люциферазы. Пакет поглотителей кислорода индуцировал увеличение активности промотора BoADH1 в 7,0 раз по сравнению с контролем, демонстрируя самый высокий гипоксический ответ. Активность промотора BoSUS1L увеличилась более чем в 5,6 раза, при этом лечение пакетом с абсорбером кислорода показало наибольшую индукцию среди методов лечения.
