Stiamo studiando come i cavoli reagiscono al basso livello di ossigeno a livello molecolare. Poiché i cavoli sono difficili da ottenere, stiamo sviluppando un sistema che utilizza cellule di cavolo isolate. Esponendo queste cellule di riserva, note anche come protoplasti, a condizioni di basso contenuto di ossigeno, possiamo studiare facilmente la loro risposta allo stress.
Lavorare con protoplasti sospesi in soluzione per studiare le risposte a basso contenuto di ossigeno è complicato. La grande sfida è mantenere una quantità sufficiente di ossigeno per i nostri campioni di controllo. Abbiamo trovato un modo per pompare l'ossigeno nel liquido.
Abbiamo convalidato il metodo attraverso saggi reporter di marcatori di ipossia. Abbiamo esaminato diversi metodi per gestire un basso contenuto di ossigeno e abbiamo scoperto che il pacchetto assorbitore di ossigeno funziona meglio. È facile da usare ed efficace, il che lo rende ideale per studiare come si comportano i protoplasti in condizioni di basso contenuto di ossigeno.
Lo studio del meccanismo molecolare nelle colture a foglia in condizioni di ipossia è stato impegnativo a causa della limitazione degli strumenti disponibili, ma con i recenti progressi abbiamo fatto grandi progressi utilizzando un sistema di protoplasti di cavolo con trattamento dell'ipossia. Questo nuovo metodo ci sta aiutando a capire quanto il basso impatto di ossigeno su queste piante a livello molecolare. In futuro, prevediamo di combinare il sistema protoplasto con l'immunoprecipitazione e i saggi reporter per illustrare il percorso di regolazione molecolare coinvolto nel cavolo durante lo stress da inondazione.
Il nostro obiettivo è identificare i principali regolatori della tolleranza alle inondazioni, che speriamo di aiutare nell'allevamento di una nuova cultivar di cavolo con una migliore tolleranza alle inondazioni. Per iniziare, riempi i fori rotondi di forma quadrata di un vassoio a 48 pozzetti con substrato per piante commerciali e semina Fuyudori e 228 semi di cavolo a circa un centimetro di profondità nel terreno di coltura. Per preparare 12,5 millilitri di soluzione enzimatica, preriscaldare una soluzione contenente 10 millimolari di MES e 0,6 molari di mannitolo a 55 gradi Celsius.
Quindi aggiungere l'1,5% di cellulasi R-10 e lo 0,75% di macerozima R-10. Mescola la soluzione e continua a scaldare a 55 gradi Celsius per 10 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione enzimatica a temperatura ambiente.
Quindi aggiungere 10 millimolari di cloruro di calcio e lo 0,1% di albumina sierica bovina. Utilizzando un filtro per siringa da 0,22 micrometri, sterilizzare la soluzione enzimatica in una piastra di Petri di nove centimetri. Dopo due o tre settimane di crescita, raccogli le piantine di cavolo al secondo stadio fogliare per l'isolamento dei protoplasti mesofilli.
Raccogli le seconde foglie vere appena espanse da cinque a otto piantine di cavolo. Usando una lama di rasoio affilata, taglia le foglie in strisce da 0,5 a 1,0 millimetri. Trasferire immediatamente le strisce fogliari nella soluzione enzimatica appena preparata.
Sottoporre le strisce di foglie di cavolo a infiltrazioni sottovuoto al buio per 30 minuti. Dopo l'infiltrazione sotto vuoto, tenere le strisce fogliari immerse nella soluzione enzimatica al buio per quattro-16 ore. Il giorno successivo, diluire la soluzione contenente protoplasti con un volume uguale di soluzione W5 per fermare la digestione enzimatica.
Per rilasciare la sospensione dei protoplasti, agitare delicatamente la miscela su un agitatore orbitale. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare la soluzione di protoplasto a 150 G per due minuti a quattro gradi Celsius.
Aggiungere 10 millilitri di soluzione W5 lungo la parete del tubo a una velocità di flusso di circa un millilitro al secondo per lavare i protoplasti pellettati. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere i protoplasti nella soluzione W5 e porre la provetta sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi rimuovere un millilitro di surnatante alla volta fino a rimuovere tutto il surnatante.
Risospendere i protoplasti in una soluzione di MMG pre-raffreddata con ghiaccio. Misurare la concentrazione di protoplasti utilizzando un emocitometro. Regolare la concentrazione finale a 4 volte 10 alla potenza di 5 protoplasti per millilitro utilizzando la soluzione MMG.
Dopo l'isolamento e la digestione notturna, la resa dei protoplasti è stata di 1,04 volte 10 alla potenza di 7 per Fuyudori e di 4,00 volte 10 alla potenza di 6 protoplasti per grammo di peso fresco per 228. L'efficienza di trasfezione del protoplasto è stata superiore al 40% sia nelle cultivar Fuyudori che in quelle 228, come dimostrato dal gene reporter GFP. Dopo aver isolato il protoplasto di cavolo, mescolare 100 microlitri di 4 volte 10 alla potenza di 4 protoplasti con 10 microlitri di plasmide e porre la miscela sul ghiaccio per 10 minuti.
Aggiungere un volume uguale di soluzione PEG appena preparata nella soluzione di protoplasto e mescolare delicatamente. Incubare la miscela di protoplasti a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Quindi aggiungere 440 microlitri di soluzione W5 per terminare la reazione.
Centrifugare i protoplasti trasfettati a 150 G per due minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione W5 arricchita di ossigeno. Trasferire i protoplasti risospesi in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti precodificata con albumina sierica bovina all'1%.
Per l'ipossia indotta da sacca che consuma ossigeno, posizionare una piastra contenente la soluzione di protoplasto W5 in un barattolo anaerobico da 3,5 litri. Quindi aggiungi due pacchetti di assorbitori di ossigeno nel barattolo per creare un ambiente ipossico. Dopo il trattamento, centrifugare i protoplasti a 150 G per due minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante e congelare i protoplasti raccolti in azoto liquido prima di procedere al doppio saggio della luciferasi. Il pacchetto di assorbimento dell'ossigeno ha indotto un aumento di 7,0 volte dell'attività del promotore BoADH1 rispetto al controllo, dimostrando la più alta risposta ipossica. L'attività del promotore BoSUS1L è aumentata di oltre 5,6 volte, con il trattamento con pacchetto di assorbitori di ossigeno che ha mostrato la maggiore induzione tra i trattamenti.
